孕婦血漿游離DNA的定量分析及在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)擬建立熒光定量PCR檢測(cè)3一磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因和男性特有Y性別決定區(qū)(sexdetermining region Y，SRY)基因的方法；分析孕婦血漿DNA片段長(zhǎng)短的分布情況；檢測(cè)不同孕周孕婦、未孕女性、異常妊娠孕婦血漿中不同來(lái)源的游離DNA含量及變化情況；探討熒光PCR方法在檢測(cè)胎兒性別等產(chǎn)前診斷中以及孕婦血漿游離DNA的定量分析在唐氏篩查和非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷中的價(jià)值。 材料與方法 1、研究對(duì)象：本

2、實(shí)驗(yàn)自2004年9月到2005年7月共收集成都市錦江區(qū)婦產(chǎn)科醫(yī)院就診的孕中期、孕晚期及唐氏高危孕婦共80例外周血標(biāo)本。其中，孕中期42例，唐氏高危21例，孕晚期17例。5例未孕且無(wú)妊娠史的健康女性作為陰性對(duì)照，1例正常健康男性作為陽(yáng)性對(duì)照。 2、實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)GAPDH和SRY序列設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針；提取正常男性外周血細(xì)胞DNA，進(jìn)行目的基因的常規(guī)PCR擴(kuò)增，回收純化PCR產(chǎn)物，分別將兩種PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化JM1

3、09大腸桿菌中，在LB中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和序列測(cè)定等方法鑒定克隆成功后制備成陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，建立了1個(gè)檢測(cè)GAPDH基因及4個(gè)SRY基因的熒光定量PCR方法。兩種方法分別檢測(cè)孕婦血漿中不同來(lái)源的DNA片段長(zhǎng)度。熒光PCR方法檢測(cè)未孕女性、孕中期孕婦、唐氏高危孕婦和孕晚期孕婦血漿游離DNA中GAPDH含量和SRY基因的有無(wú)及含量變化。統(tǒng)計(jì)方法：采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析統(tǒng)計(jì)方法。 結(jié)論 1、熒光定量PCR

4、檢測(cè)孕婦血漿DNA中GAPDH、SRY具有簡(jiǎn)便、快速、高靈敏性、高特異性等優(yōu)點(diǎn)；且閉管操作有效避免了PCR產(chǎn)物的污染；結(jié)果用拷貝數(shù)表 示，有利于對(duì)不同孕期血漿DNA含量變化進(jìn)行直接的分析和比較。 2、孕婦血漿中胎源性DNA片段長(zhǎng)度遠(yuǎn)小于母源性DNA；異常妊娠及隨著孕周的增加使得胎兒DNA在片段長(zhǎng)短等理化性質(zhì)上產(chǎn)生了一定改變；血漿DNA理化性質(zhì)分析在后續(xù)的PCR引物設(shè)計(jì)和胎兒DNA的富集具有重要的指導(dǎo)意義。 3、孕婦血漿