DC-T細(xì)胞信息傳遞的節(jié)律、溫度變化及中藥調(diào)節(jié).pdf

1、目的：
　　樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)作為免疫系統(tǒng)的哨兵，是機(jī)體粘膜屏障的重要固有免疫細(xì)胞，亦是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的橋梁作用。DC依賴其表面受體感知外界信號(hào)變化，并利用多種分子將刺激信號(hào)傳遞給初始T淋巴細(xì)胞，引起T細(xì)胞向各亞群極化，從而介導(dǎo)多種形式的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因此，DC、T細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞模式，成為左右機(jī)體免疫應(yīng)答結(jié)局的重要分子基礎(chǔ)，特別是在應(yīng)對(duì)環(huán)

2、境因素變化時(shí)，DC-T細(xì)胞間信號(hào)傳遞尤為重要，但目前這一領(lǐng)域研究成果較少，無法精確指導(dǎo)免疫治療應(yīng)用策略。中藥玉屏風(fēng)散，是防邪入侵的經(jīng)典方劑，具有廣泛的抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及增強(qiáng)免疫功能等作用。本研究擬探討自然環(huán)境因素（晝夜節(jié)律、溫度變化）對(duì)小鼠DC表型和功能相關(guān)分子及DC-T細(xì)胞間信息傳遞主要相關(guān)分子的影響，并通過中藥玉屏風(fēng)散的干預(yù)，系統(tǒng)認(rèn)識(shí)玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)DC-T細(xì)胞間異常信息交流的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.中藥玉屏風(fēng)

3、散的制備:防風(fēng)、黃芪、白術(shù)按1∶2∶2比例配伍，采用常規(guī)水煎醇沉法制備。
　　2.節(jié)律變化實(shí)驗(yàn):在8AM、12AM、4PM、8PM、12PM等各時(shí)間點(diǎn)分離小鼠外周血、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)各臟器單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)特異性熒光抗體標(biāo)記方法，檢測(cè)DC表面主要特征分子MHC-Ⅱ、共刺激分子CD86的節(jié)律變化;采用流式細(xì)胞儀胞內(nèi)外因子雙染法檢測(cè)T細(xì)胞亞群Th1(CD3十CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4

4、+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)、Treg(CD4+CD25+foxp3+)的節(jié)律變化。
　　3.低溫變化實(shí)驗(yàn):小鼠隨機(jī)分為室溫(25℃)對(duì)照組、低溫(10℃)模型組、玉屏風(fēng)小、中、大劑量組，分離各組脾臟、外周血、淋巴結(jié)及肺臟單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)特異性熒光抗體標(biāo)記方法，檢測(cè)DC表面主要特征分子MHC-Ⅱ、CCR7及共刺激分子CD86受低溫及中藥玉屏風(fēng)散的調(diào)節(jié)作用;采用流式細(xì)胞儀胞內(nèi)外因子雙染法檢測(cè)T細(xì)胞亞群Th

5、1(CD3十CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)及Treg(CD4+CD25+foxp3+)受上述因素變化的影響。
　　4.采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DC主要功能相關(guān)分子CD86、CCR7、IL-4、IL-6、IL-12、TGF-β mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠DC表型功能分子及T細(xì)胞各亞群的表達(dá)呈現(xiàn)節(jié)律性變化
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)來

6、源于淋巴結(jié)、外周血、肺臟等不同組織的DC在8AM、12AM、4PM、8PM、12PM不同時(shí)間點(diǎn)其主要表型分子MHC-Ⅱ及共刺激分子CD86的表達(dá)，結(jié)果顯示:MHC-Ⅱ及CD86的表達(dá)呈現(xiàn)節(jié)律變化，在8AM時(shí)為基礎(chǔ)水平，8AM～12AM之間表達(dá)逐漸升高，12AM至高峰。隨時(shí)間變化，到4PM逐漸下降，之后8PM～12PM則呈現(xiàn)維持基礎(chǔ)水平的小幅波動(dòng)。T細(xì)胞各亞群Th1、Th2、Th17、Treg的節(jié)律變化與DC主要表型功能分子MHC-Ⅱ及C

7、D86一致，各細(xì)胞亞群的表達(dá)亦是8AM～12AM逐漸升高，12AM至高峰，之后逐漸下降，呈現(xiàn)較低水平的波動(dòng)。
　　2.低溫條件下小鼠DC表型功能分子表達(dá)及T細(xì)胞各亞群比例降低
　　與室溫對(duì)照組(25℃)相比，低溫模型組(10℃)小鼠肛溫降低(p＜0.05); FACS檢測(cè)結(jié)果顯示DC表面分子MHC-Ⅱ的表達(dá)下降達(dá)15％以上(p＜0.05）;低溫(10℃)時(shí)，DC表面功能分子CCR7、共刺激分子CD86及其mRNA的表達(dá)均明顯

8、降低(p＜0.05）;RT-PCR結(jié)果顯示DC主要功能相關(guān)分子IL-4、IL-6、TGF-β mRNA的表達(dá)亦顯著降低(p＜0.05);低溫條件下，T細(xì)胞各亞群Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞比例及Th1/Th2、Th17/Treg比值的變化與前述DC主要功能分子的變化一致，均顯著下降(p＜0.05）。
　　3.中藥玉屏風(fēng)散顯著逆轉(zhuǎn)低溫誘導(dǎo)的DC-T細(xì)胞間異常信息傳遞
　　流式結(jié)果顯示:與低溫模型組相比，中藥玉屏風(fēng)散顯

9、著提高DC表面主要分子MHC-Ⅱ的表達(dá)(p＜0.05），趨化因子受體CCR7、共刺激分子CD86及其mRNA的表達(dá)均明顯提高(p＜0.05），玉屏風(fēng)散可降低IL-4 mRNA的表達(dá)，但對(duì)DC其他功能相關(guān)分子IL-6、IL-12、TGF-β mRNA的表達(dá)無顯著影響;玉屏風(fēng)散對(duì)Th1亞群細(xì)胞比例影響無顯著差異，但通過降低Th2亞群細(xì)胞比例，使Th1/Th2比值有所逆轉(zhuǎn)（p＜0.05），玉屏風(fēng)散組Th17亞群細(xì)胞比例有所升高，而調(diào)節(jié)性Tre

10、g細(xì)胞亞群比例降低(p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.DC-T細(xì)胞間信息傳遞呈現(xiàn)節(jié)律性變化:DC表型功能分子及T細(xì)胞各亞群的表達(dá)水平是上午較下午高，中午12點(diǎn)達(dá)峰值，之后呈較低水平的節(jié)律性波動(dòng)。
　　2.低溫條件下，DC表型功能分子MHC-Ⅱ、CCR7、CD86的表達(dá)及T細(xì)胞各亞群細(xì)胞比例表達(dá)降低，DC-T細(xì)胞間信息傳遞受抑制。
　　3.中藥玉屏風(fēng)散通過提高DC表面MHC-Ⅱ、CCR7、CD86分子表達(dá)、Th