脂多糖誘導(dǎo)COX-2與PPAR-γ表達(dá)對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶前脂肪細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)對正常來源與甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)來源眼眶成纖維細(xì)胞環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)分泌水平的影響。
　　 方法：眼眶組織分別取自眼球萎縮行義眼座植入和TAO行開眶減壓術(shù)的患者。將體外培養(yǎng)的眼眶

2、成纖維細(xì)胞，分為A組(正常對照組)與B組(TA0組)，兩組又分別分為A0～A7組及B0～B7組。A0與B0組不加任何干預(yù)藥物，A1～A3組與B1～B3組均分別采用10ng/ml(A1，B1)，100 ng/ml(A2，B2)，1000 ng/ml(A3，B3)LPS作用24h，A4～A7組與B4～B7組均采用1000 ng/ml LPS分別作用4h(A4，B4)，8h(A5，B5)，12h(A6，B6)，24h(A7，B7)。采用逆轉(zhuǎn)錄

3、聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組COX-2 mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測各組COX-2蛋白的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測上清液中PGE2的含量。
　　 結(jié)果：A0與B0組比較，COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)、PGE2的分泌差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相同濃度的LPS作用于A、B兩組細(xì)胞相同的

4、時間后，B組COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)、PGE2的分泌均較A組明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度(10ng/ml，100 ng/ml，1000 ng/ml)的LPS作用于各組細(xì)胞24h后，在A組細(xì)胞中，A2、A3組COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于A0與A1組(P<0.05)，但A2與A3組之間，以及A0與A1組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A1、A2、A3組與A0組比較，PGE2分泌水平均明顯增高，其

5、中A3組細(xì)胞上清液中PGE2的含量最高(P<0.05)；在B組細(xì)胞中，B1、B2、B3組細(xì)胞COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于B0組，其中B2與B3組COX-2 mRNA的表達(dá)及B3組COX-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)最明顯(P<0.05)，而B2與B3組之間COX-2 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B1、B2、B3組細(xì)胞PGE2分泌水平均較B0組明顯增高，其中B2與B3組細(xì)胞上清液中PGE2的含量最高(P<0.05)，而B2

6、與B3組之間PGE2的分泌水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1000 ng/ml的LPS作用于各組細(xì)胞不同時間(4h，8h，12h，24h)后，在A組細(xì)胞中，A4、A5、A6、A7組COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)較A0組均明顯增高(P<0.05)，而A4、A5、A6、A7組各組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A4、A5、A6、A7組PGE2的分泌水平較A0組均明顯增高，其中A4組細(xì)胞上清液中PGE2的含量最高；在B組

7、細(xì)胞中，B4、B5、B6、B7組COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)、PGE2的分泌水平較B0組均明顯增高(P<0.05)，其中B5組COX-2mRNA表達(dá)最強(qiáng)，B4組細(xì)胞上清液中PGE2的含量最高，而B4～B7組COX-2蛋白表達(dá)各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：LPS可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的正常來源與TAO來源的眼眶成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，使其COX-2 mRNA與蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，PGE2的分泌增加。LPS的作

8、用濃度與作用時間相同時，TAO來源眼眶成纖維細(xì)胞COX-2 mRN,A與蛋白的表達(dá)及PGE2的分泌均明顯強(qiáng)于正常來源的眼眶成纖維細(xì)胞。
　　 目的：觀察LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)后，TAO來源的眼眶成纖維細(xì)胞COX-2與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferatoractivated receptor-γ，PPAR-γ)表達(dá)及PGE2分泌水平變化對TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化的影響及其相互作用。
　　

9、 方法：眼眶組織取自TAO行開眶減壓術(shù)的患者。將體外培養(yǎng)的TAO來源眼眶前脂肪細(xì)胞，分為A組與B組，A組采用1000 ng/ml的LPS作用8h，然后常規(guī)用誘導(dǎo)分化液Ⅰ和Ⅱ誘導(dǎo)直至分化結(jié)束，B組僅用誘導(dǎo)分化液Ⅰ和Ⅱ誘導(dǎo)至分化結(jié)束。分化后的細(xì)胞以油紅O染色后，于酶聯(lián)免疫檢測儀492 nm波長處測光吸收值，以測定分化后脂肪細(xì)胞相對含量，RT-PCR與Western-blot法分別檢測COX-2及PPAR-γ mRNA與蛋白的表達(dá)，Elisa

10、檢測上清液中PGE2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：分化后油紅O染色顯示兩組細(xì)胞形態(tài)上無明顯差異。A組細(xì)胞光吸收值(A)(1.02±0.08)較B組(0.74±0.06)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組細(xì)胞分化后PPAR-γmRNA與蛋白的表達(dá)均較各自分化前明顯增高，而COX-2 mRNA與蛋白的表達(dá)及PGE2的分泌水平均較各自分化前明顯下降(P<0.05)。在誘導(dǎo)分化前，A組細(xì)胞COX-2及PPAR-γ mRNA與蛋白

11、的表達(dá)，以及細(xì)胞上清液中PGE2的含量均較B組明顯增強(qiáng)(P<0.05)；在分化后，A組細(xì)胞COX-2及PPAR-γ mRNA與蛋白的表達(dá)、PGE2的分泌均明顯強(qiáng)于B組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可使體外培養(yǎng)的TAO來源的眼眶前脂肪細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)增強(qiáng)，向脂肪細(xì)胞分化增強(qiáng)。眼眶前脂肪細(xì)胞分化后，PPAR-γ的表達(dá)顯著增強(qiáng)，而COX-2的表達(dá)及PGE2的分泌明顯減少。
　　 目的：觀察美伐他汀(M

12、evastatin，Mev)干預(yù)對TAO來源眼眶前脂肪細(xì)胞分化及COX-2與PPAR-γ表達(dá)的影響，探討其對LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分組：a.美伐他汀干預(yù)對LPS誘導(dǎo)TAO來源眼眶成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)與PGE2分泌的影響-將體外培養(yǎng)的TAO眼眶成纖維細(xì)胞，分為A組(LPS組)、B組(LPS聯(lián)合Mev組)與C組(對照組)，其中B組又分為B1、B2與B3組。A組采用1000 ng

13、/ml的LPS作用8h，B1～B3組采用1000 ng/ml的LPS分別聯(lián)合5μM(B1)、10μM(B1)、20μM(B1)的Mev作用8h， C組不加任何干預(yù)藥物在同時間段內(nèi)作為對照；b.美伐他汀干預(yù)對TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化及PPAR-γ表達(dá)的影響一將a.中的A組再分為A1～A6組，采用1000 ng/ml的LPS作用8h后，再誘導(dǎo)各組前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。分化過程中，除常規(guī)誘導(dǎo)分化液外，A1組不加任何干預(yù)藥物，A2、A3、A

14、4組在分化全程中分別加入5μM(A2組)、10μM(A3組)、20μM(A4組)的Mev，A5、A6組分別在分化的第4天(A5組)與第8天(A6組)加入10μM的Mev直至分化結(jié)束。采用油紅O染色法測定分化后脂肪細(xì)胞相對含量， RT-PCR與Western-blot法檢測COX-2與PPAR-γ mRNA與蛋白的表達(dá)， Elisa檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：B組(B1、B2、B3組)COX-2 mRNA與蛋

15、白的表達(dá)及PGE2的分泌水平均較A組明顯降低(P<0.05)。自B1至B3組，隨著美伐他汀濃度的增加，COX-2 mRNA與蛋白表達(dá)及PGE2的分泌水平均逐漸減弱，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組COX-2 mRNA與蛋白的表達(dá)及PGE2的分泌水平較之A組、B1、B2組明顯減弱，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與B3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A1、A2、A3、A4組前脂肪細(xì)胞分化后光吸收值逐漸下

16、降，分化后的細(xì)胞PPAR-γmRNA與蛋白表達(dá)均依次下降，組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對A1、A3、A5、A6組分化后細(xì)胞的光吸收值、PPAR-γ mRNA與蛋白表達(dá)分別進(jìn)行兩兩比較，除A1與A6組間的光吸收值、PPAR-γ mRNA與蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，A1、A5、A3組的光吸收值及PPAR-γmRNA與蛋白表達(dá)均依次下降，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)