AE3基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)其轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞H9c2的影響.pdf

1、目的：利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，以AE3為靶基因，設(shè)計(jì)構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序鑒定，并檢測(cè)該表達(dá)質(zhì)粒對(duì)大鼠心肌樣細(xì)胞系H9c2AE3基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究AE3基因在心肌細(xì)胞損傷及保護(hù)中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.設(shè)計(jì)具有短發(fā)央結(jié)構(gòu)的三條DNA序列，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，再克隆至載體pSilencer3.1-H1-hygro中構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒并進(jìn)行序列測(cè)定。 2.轉(zhuǎn)染

2、攜帶綠色熒光蛋白的pEGFP-N2質(zhì)粒，熒光顯微鏡觀察檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同時(shí)相的轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳時(shí)相用于后續(xù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶基因表達(dá)抑制率的分析。 3.利用構(gòu)建成功的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞，并通過RT-PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞中AE3 mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α菌株經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選可見有細(xì)菌克隆長(zhǎng)出。 2.測(cè)序鑒定表明重組質(zhì)粒中

3、含有針對(duì)AE3基因的目的序列。 3.將pEGFP—N2通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，可見H9c2心肌樣細(xì)胞胞漿內(nèi)有綠色熒光，其中轉(zhuǎn)染48h的轉(zhuǎn)染效率82±6％顯著高于轉(zhuǎn)染24h的轉(zhuǎn)染效率43±6％(P＜0.01)和轉(zhuǎn)染72h的轉(zhuǎn)染效率60±7％(P＜0.05)。因此，按48h最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的siRNA表達(dá)質(zhì)粒。 4.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中AE

4、3 mRNA的表達(dá)水平，顯示pSilencer-AE3-A可明顯降低H9c2心肌樣細(xì)胞中AE3 mRNA的表達(dá)。 5.Western blot檢測(cè)細(xì)胞中AE3蛋白的表達(dá)量，顯示pSilencer—AE3-A，pSilencer-AE3-B，pSilencer-AE3-C轉(zhuǎn)染的H9c2心肌樣細(xì)胞AE3蛋白表達(dá)分別降低61％，48％，25％。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建AE3基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilencer-AE3