Bim和PI3K-AKT在低溫致乳鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的:
　　 探討低溫對心肌細(xì)胞凋亡率、乳酸脫氫酶活性變化的影響,以及促凋亡蛋白Bim和信號通路PI3K/AKT在低溫處理后心肌細(xì)胞中的表達(dá)和作用。
　　 方法:
　　 1.取健康乳鼠(出生1-3d)心臟,利用0.08％胰酶和1.00％Ⅱ型膠原酶依次消化心肌組織,加入0.1％mM5-Brdu抑制成纖維細(xì)胞的生長,混懸液經(jīng)差速貼壁2h后,以1×106/ml的細(xì)胞密度接種于35mm的培養(yǎng)皿中,待心肌細(xì)胞生長接近匯合狀

2、念及呈現(xiàn)同步搏動時開始實(shí)驗(yàn)。
　　 2.建立心肌細(xì)胞凋亡模型,模擬低溫環(huán)境,將心肌細(xì)胞放入4℃恒溫箱處理1h,然后將心肌細(xì)胞在37℃含有5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育0h,4h,8h,12h,16h,24h.以各時間點(diǎn)正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞為對照組。選取Bim蛋白開始表達(dá)的時間點(diǎn),加入PI3K/AKT阻斷劑LY294002后2小時再進(jìn)行低溫處理,再次檢測相關(guān)指標(biāo)。
　　 3.分別用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率,MTS檢測細(xì)胞存活率。

3、Westernblotting檢測不同時間點(diǎn)Bim,PI3K,p-PI3K表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.低溫處理1h后,心肌細(xì)胞在0h的凋亡率及乳酸脫氫酶活性均較正常對照組增加(分別為20.01±1.43 vs6.79±1.50,P<0.05；43.30±2.50 vs
　　 18.13±1.57,p<0.05)。隨著復(fù)溫后心肌細(xì)胞培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞凋亡率增加,在24h組達(dá)到最高,這與乳酸脫氫酶活性水平變化一致

4、。
　　 2.Bim蛋白在低溫處理1h后即開始升高,在繼續(xù)培養(yǎng)的各時間點(diǎn),均高于對照組(P<0.05)；這與細(xì)胞凋亡率變化相一致,而各時間點(diǎn)對照組間Bim表達(dá)無明顯變化。
　　 3.加入PI3K/AKT阻斷劑LY294002(終濃度25umol/L)行低溫處理1小時后,心肌細(xì)胞凋亡率較單純低溫處理組組明顯升高(P<0.01),Bim在低溫+阻斷劑組的表達(dá)較低溫組增高(P<0.05),p-PI3K在低溫組表達(dá)較阻斷劑組和正