胸腺修飾誘導豬同種心臟移植免疫耐受及期間細胞流變學特性變化的實驗研究.pdf

1、背景及目的：經(jīng)過多年基礎(chǔ)研究和臨床實驗，同種原位心臟移植已成為一種應(yīng)用于臨床治療終末期心臟病的有效方法。目前，供心保存、外科手術(shù)技術(shù)、術(shù)后感染已不再是阻礙心臟移植成功的最主要因素。但心臟移植術(shù)后的排斥反應(yīng)、長期應(yīng)用免疫抑制劑所引起的并發(fā)癥及昂貴的醫(yī)療費用都是亟待解決的問題。同時，同種異基因器官供體遠遠不能滿足臨床的需求量。異種移植有可能解決這一矛盾，但目前的免疫抑制方案仍不足以阻止異種器官的排斥，單純增加免疫抑制劑的劑量不可能保證成功的

2、異種移植。因此，如何有效地誘導供體特異性的免疫耐受便成為解決上述問題的關(guān)鍵。 胸腺修飾這一誘導方法已經(jīng)在大鼠的心臟移植、腎移植以及胰腺移植研究中獲得很大進展。然而，很多實驗觀察到即使成功誘導免疫耐受，還是會出現(xiàn)一定程度的排斥反應(yīng)，有學者認為這種現(xiàn)象可能與受體照射或藥物處理后殘存體內(nèi)的淋巴細胞有關(guān)，如何清除這些細胞可能是誘導免疫耐受的關(guān)鍵。 同時，這一研究領(lǐng)域中，有關(guān)大動物的實驗報道甚少，對于動物免疫耐受誘導的研究較多，但

3、嚙齒類動物血管內(nèi)皮不表達MHC類抗原，其同種急性排斥反應(yīng)的機制與人類有很大不同，其程度也相對較輕。并且，從臨床應(yīng)用前景考慮，大動物模型的實驗研究也應(yīng)受到更多的重視。許多研究表明，在同種心臟移植排斥反應(yīng)過程中可見紅、白細胞聚集于心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞周圍，血管內(nèi)大量紅細胞聚集，白細胞和血小板附壁，血管腔隙變窄堵塞等微循環(huán)障礙。這些現(xiàn)象提示紅細胞、白細胞流變學特性改變是與同種移植排斥反應(yīng)及移植物失功相伴隨的關(guān)鍵因素之一。而細胞流變學在急性排

4、斥反應(yīng)期間扮演的確切角色及其發(fā)生機制目前尚不清楚。 因此，本實驗選擇豬作為實驗對象，先用X線照射破壞受體的免疫系統(tǒng)，然后采用胸腺注入供體脾細胞誘導免疫耐受，并于稍后靜脈輸注供體淋巴細胞刺激受體殘存淋巴細胞發(fā)生凋亡，再行異位心臟移植，觀察移植心存活時間，檢測混合淋巴細胞反應(yīng)，來確定免疫耐受是否發(fā)生及其程度，探尋大動物免疫耐受模型的誘導方式，為進一步的異種心臟移植研究打下基礎(chǔ)。并觀察這一期間紅、白細胞流變學特性的改變及其變化規(guī)律，進

5、一步探討和驗證其與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 課題研究分為以下三個部分： 第一部分：建立豬腹部心臟移植動物模型方法： 1．分組：供體，三元雜豬28只；受體，二元雜豬28只。共進行移植手術(shù)28例，其中正式實驗23例，預(yù)實驗5例。 2．動物模型制作：以O(shè)no術(shù)式為基礎(chǔ)，局部加以改進，將供心的升主動脈和肺動脈分別與受體的腹主動脈和下腔靜脈行端側(cè)吻合，制作豬腹腔同種異位心臟移植模型。 結(jié)果： 預(yù)實驗5例

6、，移植心存活超過3天的有2例。其他3例具體情況如下：術(shù)中受體追加麻藥過量死亡1例；血管吻合開放后心臟不復(fù)跳2例。 正式實驗23例，其中20例移植心均存活3天以上；有2例移植心未復(fù)跳；1例術(shù)后出血，于移植術(shù)后第1天死亡。 第二部分：胸腺修飾誘導豬心臟移植免疫耐受的實驗研究方法： 1．分組 共分四組，每組供受體各5頭： 空白組一受體不作任何處理，接受心臟移植； 對照組一受體接受2Gy劑量X線全

7、身照射后2周行心臟移植； 實驗A組一受體接受2Gy劑量X線全身照射的當天，進行胸腺內(nèi)注射供體脾細胞，2周后行心臟移植； 實驗B組一受體接受2Gy劑量X線全身照射的當天，進行胸腺內(nèi)注射供體脾細胞，1周后靜脈注射供體淋巴細胞，2周后行心臟移植。 2．照射后實驗動物不良反應(yīng)的觀察。 3．照射后受體淋巴細胞總數(shù)的變化。于受體豬接受照射前1天，照射后第1、3、7和14天檢測淋巴細胞總數(shù)。 4．移植心存活時間

8、的觀察。 5．混合淋巴細胞反應(yīng)的檢測。 于受體豬接受照射前1天，照射后第1周和第2周分別采供體靜脈血2ml、受體靜脈血2ml，行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，檢測其刺激效應(yīng)。 6病理學檢查：心臟停跳后切取部分心肌，進行心肌組織病理學檢查，并進行排斥反應(yīng)病理分級。7．統(tǒng)計學方法：均采用均數(shù)±標準差(X±SD)表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用One-Way ANOVA、重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗方法。P<0

9、.05為存在顯著性差異。 結(jié)果： 1．照射后不良反應(yīng)觀察對照組照射后2例出現(xiàn)嘔吐，1例出現(xiàn)拒食；實驗A組1例嘔吐，1例拒食；實驗B組1例嘔吐，1例耳后出現(xiàn)淤斑。 2．照射前后淋巴細胞總數(shù)的變化各組照射后第2天淋巴細胞總數(shù)最低，2周后恢復(fù)至照射前的30％～40％。 3．移植心存活時間空白組平均存活4.2天，對照組平均存活4.6天，實驗A組平均存活7.6天，實驗B平均存活9.6天?？瞻捉M與對照組移植心存活時間

10、無顯著差異，實驗A組與空白組及對照組比較均有顯著性差異(分別為P=0.001，P=0.003)，實驗B組與空白組及對照組比較同樣有顯著性差異(P=0.000)，實驗A組與實驗B組差異具有顯著性意義(P=0.036)。 4．MLR檢測同一時間點內(nèi)，在照射前及預(yù)處理后1周各組間均無顯著性差異(P>0.05)；預(yù)處理后2周實驗A組及實驗B組較對照組均有顯著性差異(P=0.000)，實驗A組與實驗B組之間的差異亦存在顯著性意義(P=0.

11、002)。重復(fù)測量統(tǒng)計，組間效應(yīng)比較說明預(yù)處理方法的不同對淋巴細胞反應(yīng)的影響有顯著性意義(F=6.065，P=0.015)；各時間點與預(yù)處理方法存在交互效應(yīng)(F=13.039，P=0.001)，重復(fù)因素各時間點間存在顯著性差異(113.897，P=0.000)；多重比較說明單純照射(對照組)后各時間點MLR無顯著性差異(P>0.05)，實驗A組(P<0.05)及實驗B組(P=0.000)預(yù)處理后2周較照射前MLR均有顯著性差異，實驗B組

12、預(yù)處理后2周較預(yù)處理后1周MLR之間的差異有顯著性意義(P=0.000)。5．移植心病理學檢查停跳后各組移植心病理學檢查均為4級排斥反應(yīng)。 結(jié)論： 1、胸腺修飾抗原量采用供體脾細胞10×10<'7>個/kg達到了一定效果。 2、2Gy低劑量X射線照射對受體外周淋巴細胞的清除是有效的。 3、單純X射線照射無法誘導有效的移植免疫耐受。 4、受體豬全身照射后單純胸腺修飾可誘導一定程度的免疫抑制。

13、 5、受體豬全身照射后，胸腺修飾聯(lián)合靜脈注射供體淋巴細胞誘導的免疫抑制程度較單純胸腺修飾進一步加深，但并未誘導出小動物實驗表現(xiàn)出的“永久性”免疫耐受。 第三部分：免疫耐受誘導期間細胞流變學特性的改變方法： 1．分組：同第二部分。 2．標本采集：在受體豬照射前1天、照射后第1、7、14天及移植術(shù)后1、3、5、7、9天抽取靜脈血6ml檢測。 3．紅、白細胞流變學特性檢測：測定紅細胞聚集指數(shù)(erythrocy

14、te aggregation index，EAI)、紅細胞變形指數(shù)(erythrocyte deformability index，EDI)及白細胞變形指數(shù)(leucocyte deformability index，LDI)。 4．實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義界限。各組流變學參數(shù)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析并行多重比較(LSD檢驗)。結(jié)果： 1．空白組及對照組在術(shù)前各時間點

15、與照射前無顯著差異，術(shù)后早期即出現(xiàn)紅細胞聚集指數(shù)持續(xù)升高，紅、白細胞變形性則持續(xù)下降； 2．實驗A組細胞流變學特性開始顯著惡化則發(fā)生在術(shù)后第5天； 3．實驗B組則進一步延后，在術(shù)后第9天紅細胞聚集性升高，細胞變形性顯著下降。 結(jié)論： 1、在豬同種心臟移植急性排斥反應(yīng)期間，紅細胞聚集性持續(xù)升高、紅白細胞變形性持續(xù)下降。 2、X射線照射可引起早期白細胞變形性的下降，但持續(xù)時間較短。對紅細胞聚集性及變形