表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌的中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放試驗(yàn)及我國(guó)部分養(yǎng)殖豬種F18受體基因型的檢測(cè).pdf

1、由產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(SLTEC)引起的斷奶仔豬腹瀉(PWD)和仔豬水腫病(ED)是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染病。該類大腸桿菌的致病性主要與粘附素和腸毒素/類志賀毒素兩類毒力因子有關(guān)。細(xì)菌通過(guò)粘附素附著于豬腸道上皮細(xì)胞，細(xì)菌一旦定居于小腸粘膜上，即開(kāi)始大量繁殖，并產(chǎn)生大量的毒素或侵入深部，損傷破壞組織引發(fā)疾病。引起PWD的大腸桿菌主要產(chǎn)生F4[K88]和F18兩類粘附素，致ED的大腸桿菌可產(chǎn)生F18粘附素，致ED的大腸桿菌另一個(gè)顯著特

2、點(diǎn)是可產(chǎn)生志賀毒素2變異體(Stx2e)。迄今為止，如何有效預(yù)防PWD和ED仍然是有待解決的問(wèn)題。本研究的目的是通過(guò)對(duì)本室構(gòu)建并已完成初步免疫效力研究的表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌在江蘇省的中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放試驗(yàn)的研究，評(píng)價(jià)重組菌對(duì)豬的免疫效果及其安全性，為PWD和ED的基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 與F4粘附素生物合成有關(guān)的基因簇包括10個(gè)，其中faeG編碼的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亞單位蛋白，與菌毛

3、的粘附特性有關(guān)；與Ⅰ型菌毛相似，F(xiàn)18也是由多個(gè)亞單位組成，現(xiàn)已鑒定的亞單位有A、E、F等，亞單位A(fedA)是F18粘附素的主要結(jié)構(gòu)亞單位；Stx2e由一分子的A亞單位和五分子的B亞單位的聚合體共同構(gòu)成，其中B亞單位主要與細(xì)胞受體結(jié)合有關(guān)，具有免疫原性。施慧等人構(gòu)建的重組菌BL21(pFSFaeG)有效表達(dá)了Stx2eB亞單位基因(stx2eB)、F18菌毛的A亞單位基因(fedA)和F4菌毛亞單位基因(faeG)，經(jīng)SDS-PAG

4、E和Western-blot試驗(yàn)證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)活性。楊健美等在小鼠體內(nèi)研究了重組菌經(jīng)不同途徑(口服活菌、滅活菌體腹腔免疫)免疫后的抗體產(chǎn)生情況和免疫保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)口服使用時(shí)的效果并不理想，而滅活免疫能夠在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定上升的抗體，并在二免后7～21天達(dá)到并維持著較高的抗體水平，對(duì)毒株和毒素的攻毒保護(hù)均達(dá)到80％以上。 本研究將已鑒定的高效表達(dá)目的蛋白的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后與脫脂奶制成細(xì)菌膠囊進(jìn)行活菌口服免疫或滅活后與白油

5、充分乳化制成油乳劑苗肌肉注射免疫，跟蹤檢測(cè)產(chǎn)生針對(duì)目的蛋白的特異抗體，評(píng)價(jià)其免疫效力，并跟蹤監(jiān)測(cè)其各項(xiàng)生產(chǎn)性能指標(biāo)，評(píng)價(jià)其安全性。 此外本研究還對(duì)我國(guó)部分養(yǎng)殖豬種F18受體基因型進(jìn)行了初步研究，為該病的防制與抗病育種提供了參考。 1.表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌BL21(pESFaeG)的中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放試驗(yàn)按照農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》的要求，并經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室批

6、準(zhǔn)，完成表達(dá)致PWD、ED大腸桿菌保護(hù)性抗原基因的重組菌在江蘇省的中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放試驗(yàn)。已構(gòu)建的能表達(dá)致PWD和ED大腸桿菌保護(hù)性抗原FedA-Stx2eB-FaeG融合蛋白的重組菌BL21(pFSFaeG)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌制成抗原，經(jīng)口服、滅活后與白油按一定比例制成油乳劑苗免疫試驗(yàn)豬，并用間接ELISA法定期檢測(cè)豬血清中的抗體產(chǎn)生情況?？贵w檢測(cè)結(jié)果表明，重組菌滅活油苗3日齡免疫能夠誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生針對(duì)上述三種保護(hù)性抗原的特異性I

7、gG抗體，并能長(zhǎng)時(shí)間維持較高水平，而重組菌活菌口服免疫試驗(yàn)豬所誘導(dǎo)的體液免疫、黏膜免疫水平低，效果較差。通過(guò)對(duì)免疫接種后試驗(yàn)豬在增重、死淘率及其他性能方面與對(duì)照組的差異分析，重組疫苗免疫后能起到較好的免疫保護(hù)效果，且不會(huì)對(duì)試驗(yàn)豬的生產(chǎn)性能造成不良影響。試驗(yàn)全程的監(jiān)測(cè)表明重組疫苗免疫后在體內(nèi)對(duì)腸道其它正常菌群無(wú)明顯影響，不會(huì)向環(huán)境微生物轉(zhuǎn)移，對(duì)試驗(yàn)場(chǎng)周邊的非靶動(dòng)物也沒(méi)有致病性，證明重組菌應(yīng)用于豬體預(yù)防PWD和ED是有效且安全的。

8、2.我國(guó)部分養(yǎng)殖豬種PWD、ED疑似病豬大腸桿菌F18受體基因型檢測(cè) 采用候選基因法和體外黏附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，α(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因(FUT1)可作為豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18受體(ETECF18R)的候選基因。有關(guān)測(cè)序表明，在FUT1的307bp位點(diǎn)出現(xiàn)兩個(gè)多態(tài)型，與F18大腸桿菌所致的斷奶仔豬腹瀉和水腫病易感性相關(guān)。本文采集目前我國(guó)部分地區(qū)飼養(yǎng)的3個(gè)豬種的50頭疑似斷奶仔豬腹瀉和水腫病病豬的血液樣品，用PCR方法檢測(cè)這些個(gè)體的

9、ECF18R的基因型，同時(shí)采集糞樣進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。結(jié)果表明受檢的三個(gè)豬種的50頭病豬在FUT1基因M307位點(diǎn)均存在多態(tài)性，按AA、AG和GG三種基因型分布；19頭長(zhǎng)大二元雜交豬和16頭三元雜交豬中，F(xiàn)UT1基因M307擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后均有個(gè)體產(chǎn)生三種類型的片段，且以敏感型(GG型和AG型)居多，平均占91％；而在15個(gè)含國(guó)內(nèi)地方血統(tǒng)的土雜豬中，只有兩種類型的片段。從50頭病豬分離到的50株大腸桿菌，測(cè)出了其中29個(gè)分離株的O血清型，