不同糖濃度培養(yǎng)對人肝細(xì)胞LO2鐵代謝相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、鐵作為人體必需的微量元素，廣泛參與體內(nèi)的代謝過程。鐵缺乏和鐵過量對機(jī)體都將產(chǎn)生不良影響。肝臟是機(jī)體主要的鐵貯存部位，同時(shí)在鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著中心和樞紐作用，鐵調(diào)素等許多重要的鐵代謝相關(guān)蛋白都是肝臟特異性合成分泌的。細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)主要通過IRE/IRP系統(tǒng)調(diào)節(jié)，機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)主要通過一種阻止鐵進(jìn)入血液的激素hepcidin調(diào)控。
　　 相關(guān)臨床資料和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)糖尿病組的血清鐵水平比對照組高，糖尿病隨病情發(fā)展常伴有鐵蓄積加重。

2、體外實(shí)驗(yàn)顯示，用20mmol/L濃度葡萄糖處理小鼠胰島組織，其H-鐵蛋白mRNA比1mmol/L濃度的要高出4-8倍。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中，TfR表達(dá)增加。另有實(shí)驗(yàn)表明，高糖可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS。過多的ROS除了直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用外，還能夠通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　 越來越多的證據(jù)揭示，鐵代謝和糖代謝之間存在相互影響，二者的關(guān)系可能是雙向的，即鐵代謝異?？梢杂绊懱谴x；而長期高血糖又可

3、損傷鐵代謝通路。但確切的機(jī)制尚未完全闡明。
　　 目的:
　　 利用體外培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞LO2，設(shè)定不同葡萄糖濃度培養(yǎng)環(huán)境，觀察不同濃度葡萄糖對細(xì)胞鐵代謝調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為探討糖代謝與鐵代謝的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 一、不同糖濃度培養(yǎng)對LO2細(xì)胞ROS、MDA水平和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞分組：LO2細(xì)胞(購自中科院上海細(xì)胞庫)，分為5.5mmol/L組，15m

4、mol/L組和25 mmol/L組。培養(yǎng)基為DMEM，加2％新生牛血清和青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，葡萄糖濃度分別為5.5mmol/L，15mmol/L和25 mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間分別為0h，12h，24h和48h。
　　 指標(biāo)測定：用熒光染色法檢測細(xì)胞ROS水平；用TBA法檢測細(xì)胞MDA水平；用蛋白免疫印跡法檢測鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(TfR2)、鐵調(diào)素(hep

5、cidin)蛋白表達(dá)量。
　　 二、過氧化氫對LO2細(xì)胞ROS、MDA水平和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞分組：LO2細(xì)胞用終濃度為100μmol/L過氧化氫處理，對照組只加入等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為DMEM，加2％新生牛血清和青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，葡萄糖濃度為5.5mmol/L。培養(yǎng)時(shí)間為60mik。
　　 指標(biāo)測定：用熒光染色法檢測細(xì)胞ROS水平；用TBA法檢測細(xì)胞MDA水平；用蛋

6、白免疫印跡法檢測鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(TfR2)、鐵調(diào)素(hepcidin)蛋白表達(dá)量。
　　 三、Vit.E對不同糖濃度培養(yǎng)LO2細(xì)胞ROS、MDA水平和鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 細(xì)胞分組：LO2細(xì)胞分為5.5mmol/L組，15mmol/L組和25 mmol/L葡萄糖組培養(yǎng)，各濃度葡萄糖組又分為C.1mg/L、1mg/L和10mg/L的Vit.E處理組，各濃度葡萄

7、糖對照組只加入等量相應(yīng)葡萄糖濃度培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為DMEM，加2％新生牛血清和青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml，葡萄糖濃度分別為5.5mmol/L，15mmol/L和25mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間為24h。
　　 指標(biāo)測定：用熒光染色法檢測細(xì)胞ROS水平；用TBA法檢測細(xì)胞MDA水平；用蛋白免疫印跡法檢測鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(TfR2)、鐵調(diào)素(hepcidin)蛋白表達(dá)量。

8、
　　 各組實(shí)驗(yàn)的圖象分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(X±S)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析。
　　 結(jié)論:
　　 本研究設(shè)定5mmol/L、15mmol/L和25mmol/L三個(gè)葡萄糖濃度培養(yǎng)環(huán)境，觀察在不同濃度葡萄糖條件下體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞LO2鐵代謝調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1.LO2細(xì)胞ROS和M

9、DA水平隨培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間延長而升高。
　　 2.LO2細(xì)胞IRP1、TfR1、TfR2隨培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高而升高。
　　 3.在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加過氧化氫可直接誘導(dǎo)LO2細(xì)胞IRP1、TfR1、TfR2表達(dá)顯著升高。
　　 4.Vit.E能夠降低高糖培養(yǎng)細(xì)胞活性氧的含量，緩解IRP1、TfR1、TfR2蛋白表達(dá)增加的幅度。
　　 5.hepcidin在高糖培養(yǎng)下表達(dá)升高，而在過氧化