重金屬對(duì)LO2細(xì)胞的Hormesis效應(yīng)及其與蛋白質(zhì)相互作用的研究.pdf

1、自然界中的鎘和汞廣泛存在于各種環(huán)境介質(zhì)(空氣、水、土壤)中。環(huán)境中鎘、汞污染主要來(lái)自采礦、冶煉及電子等工業(yè)生產(chǎn)過程。鎘、汞及其化合物可通過呼吸道、皮膚或消化道等不同途徑侵入人體。在血液中它們可以與血清蛋白結(jié)合而被轉(zhuǎn)運(yùn)到機(jī)體多種器官和組織。急性或慢性接觸都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多種組織器官的損傷。
　　劑量一效應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)的重要概念,一直用于對(duì)有害因素進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)和外推,衛(wèi)生管理部門也以此為基礎(chǔ)進(jìn)行有害因素的風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估。傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估有兩種

2、基本模型:即閾值模型和線性非閾值模型。近年來(lái),在全社會(huì)的共同努力下,高濃度接觸所致的急性中毒的情況已大為減少,而大多為低濃度、甚至極低濃度的接觸。大量研究發(fā)現(xiàn),有毒物質(zhì)在低劑量時(shí)表現(xiàn)出對(duì)生物體有利的刺激作用。然而這兩種毒理學(xué)模型都不能對(duì)低劑量有毒物質(zhì)的量效關(guān)系進(jìn)行有效評(píng)價(jià),因此,毒理學(xué)界也提了一種新的劑量一效應(yīng)關(guān)系模型-Hormesis模型,以充實(shí)和完善現(xiàn)行的風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估的毒理學(xué)理論。
　　血清白蛋白是脊椎動(dòng)物血漿中含量最豐富的蛋白

3、質(zhì),在機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)外源性物質(zhì)過程中起著非常重要的的作用。重金屬與蛋白質(zhì)結(jié)合會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,同時(shí)也影響重金屬在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布及毒性作用。因此,了解重金屬與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)我們至關(guān)重要。近幾年,許多光譜學(xué)方法被用來(lái)研究白蛋白與小分子物質(zhì)f特別是藥物)之間的相互作用。這些方法靈敏度高,選擇性好,操作簡(jiǎn)單,而且具有豐富的理論基礎(chǔ)。通過這些方法,我們可以了解重金屬與蛋白質(zhì)的作用部位、作用力類型、結(jié)合解離常數(shù)以及對(duì)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的影響等

4、等。然而,到目前為止,用光譜學(xué)方法探討蛋白質(zhì)與重金屬相互作用的研究甚少。
　　本論文第一部分探討了不同濃度的鎘、汞對(duì)L02生長(zhǎng)的影響,并深入探討了ROS、GSH-PX和SOD在鎘、汞所致L02生長(zhǎng)興奮效應(yīng)過程中的變化及其規(guī)律。從而提供了穩(wěn)定的鎘、汞所致L02生長(zhǎng)興奮效應(yīng)模型,揭示了重金屬所致細(xì)胞增殖興奮效應(yīng)的部分分子機(jī)制。本論文第二部分利用熒光光譜、紫外光譜和圓二色譜探討了氯化汞與血清白蛋白的相互作用,以了解在一定條件下重金屬與血

5、清蛋白之間的作用部位、作用力類型以及結(jié)合解離常數(shù);并期望通過光譜分析重金屬對(duì)白蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響,從分子水平上探討重金屬一蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理等。這對(duì)了解重金屬在體內(nèi)的代謝及其毒性效應(yīng)的機(jī)制有實(shí)際意義,同時(shí)對(duì)探討白蛋白分子與其它物質(zhì)的結(jié)合形式以及反應(yīng)機(jī)理等具有重要意義。
　　本論文分為兩個(gè)部分:
　　第一部分:重金屬對(duì)L02細(xì)胞的Hormesis效應(yīng)及機(jī)制研究
　　目的探討低劑量重金屬鎘、汞單獨(dú)及等濃度聯(lián)合作用對(duì)人胚肝

6、細(xì)胞(L02)生長(zhǎng)的興奮效應(yīng)及可能的機(jī)制。方法以體外培養(yǎng)的L02細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,不同濃度的鎘、汞單獨(dú)及等濃度聯(lián)合處理L0224hr后,用V/_CELLTMXR活力分析儀分析細(xì)胞生長(zhǎng)狀況;根據(jù)Finney數(shù)學(xué)模型和Logistic回歸方法判斷聯(lián)合作用類型;按照二硫代二硝基苯甲酸比色法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)與超氧化物歧化酶(SOD)的活性;依據(jù)ParvinderKaur的檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;火焰原子

7、吸收光譜法及原子熒光法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鎘、汞吸收量。結(jié)果低劑量的汞(0.01、0.05、0.25μol/L)、鎘(0.01、0.05、0.25μmol/L)及鎘+汞(O.Olμmol/L)處理24hr能明顯刺激L02細(xì)胞生長(zhǎng);Finney數(shù)學(xué)模型顯示鎘+汞等濃度聯(lián)合作用于L02細(xì)胞24hr后Q=1.9,說(shuō)明其聯(lián)合作用屬于簡(jiǎn)單相加作用;低劑量的鎘、汞單獨(dú)及聯(lián)合處理L02細(xì)胞24hr均能明顯誘導(dǎo)SOD與GSH-PX活性升高,當(dāng)劑量增大到一定水

8、平(25.6μmol/L)后又抑制兩種酶活性。細(xì)胞內(nèi)ROS水平與重金屬吸收量隨染毒劑量增加而增加。結(jié)論低濃度重金屬鎘、汞單獨(dú)及等濃度聯(lián)合作用對(duì)L02生長(zhǎng)存在Hormesis效應(yīng),其機(jī)制可能是低濃度鎘、汞誘導(dǎo)細(xì)胞GSH-PX、SOD活性增強(qiáng),清除過量的自由基,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,提高細(xì)胞存活率。
　　第二部分:重金屬汞與血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究
　　目的探討汞與血清白蛋白相互作用的機(jī)理及其對(duì)白蛋白構(gòu)象的影響。方法模擬生

9、理?xiàng)l件下,測(cè)定研究體系在三個(gè)不同溫度(298,304,310K)下的熒光猝滅光譜;用Stern-Volmer、修正的Stern-Volmer方程和Van'tHoff方程分別處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù);根據(jù)Forster能量共振轉(zhuǎn)移理論計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)距色氨酸殘基的距離。同時(shí),室溫下測(cè)定研究體系的紫外吸收光譜、圓二色譜及三維熒光光譜,以探討氯化汞對(duì)白蛋白構(gòu)象的影響。結(jié)果三個(gè)溫度(298,304,310K)下測(cè)得氯化

10、汞猝滅HSA和BSA反應(yīng)的猝滅常數(shù)分別為(2.099,1.828,l.703x103Lmol-1)和(1.015,0.967,0.934×l03Lmol.1);結(jié)合常數(shù)分別為(6.922,5.235,4.158x103M-1)和(1.782,1.513,1.261xl03M-l);根據(jù)vant,tHoff方程計(jì)算出氯化汞與HSA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔS、AH和AG分別為-36.051Jmol.1K-1,-32.635kjmol.1和(-21

11、.908,-21.643,-21.476kjmol.1),與BSA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔSΔH和ΔG分別為-11.989Jmol-lK-1,-22.127KJmol-1和(-18.545,-18.505,-18.400);按照Forster共振論能量轉(zhuǎn)移理論得出氯化汞與HSA和BSA色氨酸殘基的距離r分別為1.71nm和1.97nm。紫外吸收光譜顯示氯化汞加入后,HSA的肽鍵吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)并且最大吸收波長(zhǎng)逐漸紅移;圓二色譜顯示隨著氯化汞

12、濃度增大,HSA和BSA的0【螺旋含量先略有增加(HSA由61.25％至61.69%,BSA由50.93%至56.29%),后逐漸降低(HSA由61.69%降至46.77%,BSA由56.29%降至45.01%);三維熒光光譜顯示HSA峰a強(qiáng)度明顯升高(312.8～542.1),峰l強(qiáng)度略有下降(495.1～462.4),峰2強(qiáng)度顯著降低(474.2～334.7);BSA峰a強(qiáng)度也明顯升高(139.0～206.4),峰1強(qiáng)度略有下降(3

13、79.6～360.4),峰2強(qiáng)度顯著降低(591.8～464.8);兩種白蛋白峰1和峰2的最大發(fā)射波長(zhǎng)均輕微紅移(1～2nm)。結(jié)論氯化汞與HSA和BSA血清白蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng);此結(jié)合反應(yīng)是放熱反應(yīng),溫度升高對(duì)反應(yīng)不利;范德華力是維系復(fù)合物穩(wěn)定的主要作用力;兩種白蛋白與氯化汞之間可發(fā)生有效的能量共振轉(zhuǎn)移。同時(shí),氯化汞的存在對(duì)HSA和BSA構(gòu)象也有一定得影響:氯化汞的介入使白蛋白主鏈出現(xiàn)一定程度的解鏈,0【螺旋結(jié)構(gòu)部分瓦解,包埋在分子