氫醌誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡及NAD（P）H：醌氧化還原酶1的表達(dá).pdf

1、目的：體外研究苯的代謝產(chǎn)物氫醌誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡，及其誘導(dǎo)的醌氧化還原酶1(NAD(P)H：QuinoneOxidoreductase1，NQO1)活性的表達(dá)在此凋亡中的作用。 方法：采集志愿者的外周血，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，檢測(cè)其濃度和純度。在特定的引物下，合適的PCR條件下進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。然后用限制性內(nèi)切酶HinfI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切的結(jié)果，抽取NQO1基因型分別為C/C和T/T兩種類型志愿

2、者的骨髓，并以此為依據(jù)進(jìn)行分組。用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓，得到單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞置于含有15％小牛血清+IMDM的液體培養(yǎng)體系中，調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×106/ml，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)和表面的抗原Stro-1的表達(dá)來鑒定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠的數(shù)量后，將細(xì)胞均勻的接種在96孔培養(yǎng)板中，分別加入終濃度為0uM、10uM、20uM、40uM、80uM

3、、160uM的氫醌，并于0、4、8、12、16小時(shí)處，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞的活力；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和HQ的毒性，從以上來觀察HQ對(duì)MSCs的毒性作用，亦可以篩選出HQ誘導(dǎo)MSCs發(fā)生凋亡的理想濃度和理想時(shí)間，及NQO1發(fā)生突變后該結(jié)果的異同。并用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI法在第12小時(shí)處檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡。同樣，用六個(gè)濃度的HQ作用MSCs五個(gè)時(shí)間，然后用比色法測(cè)定吸光度來反應(yīng)NQO1酶的活性，觀察HQ濃度和作用

4、時(shí)間對(duì)NQO1酶活性表達(dá)的影響。先用低濃度的HQ(10uM)(以PBS作為對(duì)照)預(yù)先與MSCs作用12小時(shí)，然后用0uM、10uM、20uM、40uM、80uM、160uM的HQ與MSCs作用12小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞NQO1的活性和MSCs凋亡率，來觀察預(yù)先用低濃度的HQ處理能否更容易誘導(dǎo)NQO1酶活性的表達(dá)，更易產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。 結(jié)論：人體內(nèi)的NQO1酶存在著基因的多態(tài)性，突變?cè)?09位點(diǎn)，C→T。當(dāng)其發(fā)生突變后酶的活性消失，