體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細胞分化為類許旺細胞的進一步實驗研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)損傷缺損的臨床治療是外科領(lǐng)域尚未解決的世界難題。自體神經(jīng)移植是治療周圍神經(jīng)缺損的標準方法，但會造成供區(qū)神經(jīng)損傷。通過組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損是目前臨床治療研究的熱點。人工神經(jīng)的種子細胞為許旺細胞(Schwann cells,SCs)，其來源問題尚未解決。人臍血間充質(zhì)干細胞(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)作為人骨髓間充質(zhì)干細胞（

2、Mesenchymal stem cells,MSCs）的一種替代來源，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可以向類SCs分化，但還需進一步進行研究。
　　目的：本研究旨在建立HUCBMSCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定體系，探討體外誘導(dǎo)HUCBMSCs定向分化為類SCs的方法，并優(yōu)化誘導(dǎo)方案；進一步將誘導(dǎo)成功的類SCs復(fù)合去細胞神經(jīng)基膜管體外共培養(yǎng)，示蹤。
　　方法：取人臍血標本，6％羥乙基淀粉(Hetastarch, HES)沉降紅細胞，再

3、使用人淋巴細胞分離液Ficoll（密度為1.077g/mL）分離臍血單個核細胞，在Mesencult?完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，流式細胞儀對培養(yǎng)細胞進行表型測定，向成骨、成脂方向分化鑒定其多向分化的潛能；取第3代細胞進行定向誘導(dǎo)分化，免疫細胞化學法、RT-PCR、Western Blotting等方法對誘導(dǎo)后的細胞進行神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物S100b、GFAP、P75鑒定；采用反復(fù)凍融振蕩洗滌法制備去細胞坐骨神經(jīng)基膜管，將誘導(dǎo)后類SCs使用微量注射

4、器注入去細胞基膜管中置入六孔板體外培養(yǎng)0、1、2W，然后取出標本行HE染色檢測。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)出的細胞低表達或不表達CD34，高表達CD44、CD73，免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)4d后幾乎所有細胞都表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物 S100b(98±1.63%)、GFAP(95.33±2.05%)和P75(90.67±1.7%)，其中較多細胞表現(xiàn)出SCs經(jīng)典的雙極、梭形形態(tài)，同時RT-PCR、Western Blotting在基因和蛋

5、白水平證明誘導(dǎo)后細胞表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物S100b、GFAP和P75，而未分化細胞不表達；HE染色檢測結(jié)果顯示去細胞基膜管中細胞可以存活并有遷移趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.人臍血中可以成功分離出MSCs，HUCBMSCs在體外具有較強的增殖、自我更新能力，還具有多向分化潛能。
　　2. HUCBMSCs在體外可以定向分化為類許旺細胞。
　　3.類SCs可以在去細胞基膜管中存活、遷移，有望成為新的種子細胞來源且為