體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分化為類許旺細(xì)胞的進(jìn)一步實驗研究.pdf

1、背景：周圍神經(jīng)損傷缺損的臨床治療是外科領(lǐng)域尚未解決的世界難題。自體神經(jīng)移植是治療周圍神經(jīng)缺損的標(biāo)準(zhǔn)方法，但會造成供區(qū)神經(jīng)損傷。通過組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損是目前臨床治療研究的熱點。人工神經(jīng)的種子細(xì)胞為許旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)，其來源問題尚未解決。人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)作為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（

2、Mesenchymal stem cells,MSCs）的一種替代來源，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可以向類SCs分化，但還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。
　　目的：本研究旨在建立HUCBMSCs的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定體系，探討體外誘導(dǎo)HUCBMSCs定向分化為類SCs的方法，并優(yōu)化誘導(dǎo)方案；進(jìn)一步將誘導(dǎo)成功的類SCs復(fù)合去細(xì)胞神經(jīng)基膜管體外共培養(yǎng)，示蹤。
　　方法：取人臍血標(biāo)本，6％羥乙基淀粉(Hetastarch, HES)沉降紅細(xì)胞，再

3、使用人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll（密度為1.077g/mL）分離臍血單個核細(xì)胞，在Mesencult?完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表型測定，向成骨、成脂方向分化鑒定其多向分化的潛能；取第3代細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR、Western Blotting等方法對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100b、GFAP、P75鑒定；采用反復(fù)凍融振蕩洗滌法制備去細(xì)胞坐骨神經(jīng)基膜管，將誘導(dǎo)后類SCs使用微量注射

4、器注入去細(xì)胞基膜管中置入六孔板體外培養(yǎng)0、1、2W，然后取出標(biāo)本行HE染色檢測。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)出的細(xì)胞低表達(dá)或不表達(dá)CD34，高表達(dá)CD44、CD73，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)4d后幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 S100b(98±1.63%)、GFAP(95.33±2.05%)和P75(90.67±1.7%)，其中較多細(xì)胞表現(xiàn)出SCs經(jīng)典的雙極、梭形形態(tài)，同時RT-PCR、Western Blotting在基因和蛋

5、白水平證明誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100b、GFAP和P75，而未分化細(xì)胞不表達(dá)；HE染色檢測結(jié)果顯示去細(xì)胞基膜管中細(xì)胞可以存活并有遷移趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.人臍血中可以成功分離出MSCs，HUCBMSCs在體外具有較強的增殖、自我更新能力，還具有多向分化潛能。
　　2. HUCBMSCs在體外可以定向分化為類許旺細(xì)胞。
　　3.類SCs可以在去細(xì)胞基膜管中存活、遷移，有望成為新的種子細(xì)胞來源且為