層黏素受體過表達(dá)在膽管癌細(xì)胞免疫逃逸過程中的作用初步探討.pdf

1、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)、多階段的過程，除與腫瘤細(xì)胞本身粘附、運(yùn)動、增殖、降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)及腫瘤血管生成等有關(guān)外，機(jī)體的免疫系統(tǒng)在該過程中也具有重要作用。腫瘤細(xì)胞通過逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和攻擊，進(jìn)而在體內(nèi)不受限制的生長和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Fas/FasL系統(tǒng)是體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對糖蛋白分子，在免疫自穩(wěn)、免疫特赦，維持眼、睪丸、胎盤等生理性免疫赦免組織的正常功能，以及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中意義

2、顯著。在腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)as表達(dá)下降，F(xiàn)as配體(Fasligand，F(xiàn)asL)表達(dá)增加，直接參與或間接促進(jìn)了腫瘤逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而有利于腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。 細(xì)胞跨膜糖蛋白層黏素受體(lamininreceptor，LNR)過表達(dá)是惡性實(shí)體腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的共同現(xiàn)象，鑒于Fas/FasL介導(dǎo)的免疫逃逸在侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用，我們推測，LNR過表達(dá)可能是通過對Fas/FasL系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，參與了腫瘤細(xì)胞的免疫

3、逃逸過程，進(jìn)而發(fā)揮了對侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。腫瘤細(xì)胞表面的細(xì)胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)是參與介導(dǎo)細(xì)胞間粘附、識別的重要因子。它是淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1(lymphocytefunctionassociatedantigen-1，LFA-1)的主要配體，是細(xì)胞粘附遷移及提呈抗原的重要介導(dǎo)分子。腫瘤細(xì)胞膜表面ICAM-1表達(dá)減少或丟失，將使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、N

4、K細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的識別和殺傷作用。鑒于LNR過表達(dá)介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的多個重要環(huán)節(jié)，LNR和ICAM-1在腫瘤細(xì)胞之間的關(guān)系密切，LNR有可能會通過ICAM-1在介導(dǎo)免疫逃逸的過程中發(fā)揮作用。因此我們推想，LNR過表達(dá)可能通過改變ICAM-1等細(xì)胞表面重要分子的表達(dá)，干擾免疫活性細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和結(jié)合，通過Fas/FasL信號通路的介導(dǎo)，阻礙免疫活性細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攻擊，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞層黏素受體的表達(dá)，

5、干擾腫瘤細(xì)胞中免疫逃逸的信號通路，將有可能降低腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力，從而可能達(dá)到限制其侵襲和轉(zhuǎn)移的目的。 課題研究內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下： 一、LNR過表達(dá)對膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。用流式細(xì)胞技術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測膽管癌細(xì)胞層黏素受體的表達(dá)并分選高表達(dá)層黏素受體的膽管癌細(xì)胞亞群；用HE染色、掃描電鏡及透射電鏡觀察分選前、后兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；用細(xì)胞骨架染色法觀察兩組細(xì)胞的骨架蛋白變化；用隨機(jī)運(yùn)

6、動實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力變化。 二、LNR過表達(dá)對膽管癌細(xì)胞免疫逃逸相關(guān)因子的影響。設(shè)計(jì)層黏素受體RNA干擾(RNAinterfere，RNAi)序列，構(gòu)建RNAi質(zhì)粒，經(jīng)測序、鑒定符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求后轉(zhuǎn)染至高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群中，沉默層黏素受體在基因和蛋白水平表達(dá)。用定量PCR、westernblot以及明膠酶譜法檢測膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前、后的某些基因(FasL、MMP-2、MMP-9、ICAM-1等)

7、功能改變。 三、LNR過表達(dá)對膽管癌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響及其機(jī)制。用基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑(GM6001)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的活性，觀察兩組細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)變化并分析可能的機(jī)制。 四、膽管癌LNR過表達(dá)對免疫活性細(xì)胞的影響。建立膽管癌細(xì)胞與人Jurka

8、t細(xì)胞TranswellR小室旁分泌共培養(yǎng)模型，用TUNEL法檢測膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染層黏素受體RNA干擾質(zhì)粒前、后對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響，并分析層黏素受體可能參與膽管癌免疫逃逸的分子機(jī)制。 本組實(shí)驗(yàn)主要的結(jié)果如下： 1.用流式細(xì)胞技術(shù)成功分選出高表達(dá)層黏素受體的膽管癌細(xì)胞亞群。用HE染色觀察分選前、后兩組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果，兩組細(xì)胞HE染色可見，細(xì)胞體均呈圓形、橢圓形、紡錘形，偶見多角形，大小不一，折光性強(qiáng)；細(xì)胞膜

9、清晰、完整，核質(zhì)較大；胞核界限清楚，可見一至多個核仁，核分裂相多見?？傮w上看，高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群的胞體較低表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞的胞體伸展，胞膜表面突起增多，異型性更明顯。 2.細(xì)胞骨架蛋白染色觀察，兩組膽管癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)清晰可見骨架蛋白(微絲、微管和中間纖維)呈藍(lán)色絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，近核側(cè)較致密，相鄰細(xì)胞間有骨架束彼此穿行。整體上看兩組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)分布類似，排列較規(guī)則，而高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)明顯紊亂，

10、斑點(diǎn)狀肌動蛋白小體、胞體突起及胞膜表面長絲狀結(jié)構(gòu)增多。 3.掃描電鏡和透射電鏡下，膽管癌細(xì)胞均呈大小不等的橢圓形或短梭形，但高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群的胞體表面突起較低表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞明顯增多，片狀偽足寬厚，絲狀偽足細(xì)長而密集。 4.隨機(jī)運(yùn)動實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群的運(yùn)動和侵襲能力較低表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞明顯增強(qiáng)。 5.成功構(gòu)建層黏素受體RNAi質(zhì)粒，經(jīng)測序、鑒定符合實(shí)驗(yàn)設(shè)

11、計(jì)要求。 6.高表達(dá)層黏素受體膽管癌細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)染層黏素受體RNAi質(zhì)粒后，伴隨膽管癌細(xì)胞層黏素受體表達(dá)的下調(diào)，膽管癌細(xì)胞的黏附能力下降，膽管癌細(xì)胞的MMP-2、MMP-9、uPAmRNA及蛋白表達(dá)降低，而膽管癌細(xì)胞表面ICAM-1的mRNA及蛋白表達(dá)卻增加。用基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑(GM6001)抑制MMP-2和MMP-9的活性后，膽管癌細(xì)胞表面ICAM-1的蛋白表達(dá)較對照組明顯增加。說明膽管癌細(xì)胞層黏素受體高表達(dá)可增加MM

12、P-2、MMP-9活性，可能降解腫瘤細(xì)胞表面ICAM-1，進(jìn)而逃避機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞免疫逃逸。 7.轉(zhuǎn)染層黏素受體RNAi質(zhì)粒至高表達(dá)層黏素受體的膽管癌細(xì)胞亞群中后發(fā)現(xiàn)膽管癌的層黏素受體表達(dá)下降，與此同時，膽管癌FasL在基因和蛋白水平的表達(dá)也均隨之降低。本實(shí)驗(yàn)可初步得出在膽管癌細(xì)胞中層黏素受體過表達(dá)可能與FasL的表達(dá)有內(nèi)在的聯(lián)系。 8.人Jurkat細(xì)胞與膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，Jurkat細(xì)胞的凋亡指數(shù)

13、明顯增加。層黏素受體RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞能減弱膽管癌細(xì)胞誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡。初步證明膽管癌細(xì)胞層黏素受體過表達(dá)可能在膽管癌細(xì)胞免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1.膽管癌細(xì)胞中層黏素受體高表達(dá)可明顯增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。 2.膽管癌細(xì)胞LNR過表達(dá)，通過分泌MMP-2、MMP-9及uPA等蛋白分子，降解膽管癌細(xì)胞表面的黏附分子(ICAM-1)等物質(zhì)，將使膽管癌細(xì)胞逃避細(xì)