層黏素受體過表達在膽管癌細胞免疫逃逸過程中的作用初步探討.pdf

1、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)、多階段的過程，除與腫瘤細胞本身粘附、運動、增殖、降解細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)及腫瘤血管生成等有關(guān)外，機體的免疫系統(tǒng)在該過程中也具有重要作用。腫瘤細胞通過逃避機體的免疫監(jiān)視和攻擊，進而在體內(nèi)不受限制的生長和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。Fas/FasL系統(tǒng)是體內(nèi)介導(dǎo)細胞凋亡的一對糖蛋白分子，在免疫自穩(wěn)、免疫特赦，維持眼、睪丸、胎盤等生理性免疫赦免組織的正常功能，以及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中意義

2、顯著。在腫瘤細胞中，F(xiàn)as表達下降，F(xiàn)as配體(Fasligand，F(xiàn)asL)表達增加，直接參與或間接促進了腫瘤逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而有利于腫瘤細胞的進展和轉(zhuǎn)移。 細胞跨膜糖蛋白層黏素受體(lamininreceptor，LNR)過表達是惡性實體腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的共同現(xiàn)象，鑒于Fas/FasL介導(dǎo)的免疫逃逸在侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用，我們推測，LNR過表達可能是通過對Fas/FasL系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，參與了腫瘤細胞的免疫

3、逃逸過程，進而發(fā)揮了對侵襲和轉(zhuǎn)移的促進作用。腫瘤細胞表面的細胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)是參與介導(dǎo)細胞間粘附、識別的重要因子。它是淋巴細胞相關(guān)抗原-1(lymphocytefunctionassociatedantigen-1，LFA-1)的主要配體，是細胞粘附遷移及提呈抗原的重要介導(dǎo)分子。腫瘤細胞膜表面ICAM-1表達減少或丟失，將使腫瘤細胞逃避細胞毒性T淋巴細胞、N

4、K細胞等免疫活性細胞的識別和殺傷作用。鑒于LNR過表達介導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的多個重要環(huán)節(jié)，LNR和ICAM-1在腫瘤細胞之間的關(guān)系密切，LNR有可能會通過ICAM-1在介導(dǎo)免疫逃逸的過程中發(fā)揮作用。因此我們推想，LNR過表達可能通過改變ICAM-1等細胞表面重要分子的表達，干擾免疫活性細胞對腫瘤細胞的識別和結(jié)合，通過Fas/FasL信號通路的介導(dǎo)，阻礙免疫活性細胞對腫瘤細胞的攻擊，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。通過下調(diào)腫瘤細胞層黏素受體的表達，

5、干擾腫瘤細胞中免疫逃逸的信號通路，將有可能降低腫瘤細胞的免疫逃逸能力，從而可能達到限制其侵襲和轉(zhuǎn)移的目的。 課題研究內(nèi)容及實驗設(shè)計如下： 一、LNR過表達對膽管癌細胞生物學行為的影響。用流式細胞技術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測膽管癌細胞層黏素受體的表達并分選高表達層黏素受體的膽管癌細胞亞群；用HE染色、掃描電鏡及透射電鏡觀察分選前、后兩組細胞形態(tài)學的變化；用細胞骨架染色法觀察兩組細胞的骨架蛋白變化；用隨機運

6、動實驗和侵襲實驗觀察兩組細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力變化。 二、LNR過表達對膽管癌細胞免疫逃逸相關(guān)因子的影響。設(shè)計層黏素受體RNA干擾(RNAinterfere，RNAi)序列，構(gòu)建RNAi質(zhì)粒，經(jīng)測序、鑒定符合實驗設(shè)計要求后轉(zhuǎn)染至高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群中，沉默層黏素受體在基因和蛋白水平表達。用定量PCR、westernblot以及明膠酶譜法檢測膽管癌細胞轉(zhuǎn)染前、后的某些基因(FasL、MMP-2、MMP-9、ICAM-1等)

7、功能改變。 三、LNR過表達對膽管癌細胞ICAM-1表達的影響及其機制。用基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑(GM6001)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的活性，觀察兩組細胞的ICAM-1表達變化并分析可能的機制。 四、膽管癌LNR過表達對免疫活性細胞的影響。建立膽管癌細胞與人Jurka

8、t細胞TranswellR小室旁分泌共培養(yǎng)模型，用TUNEL法檢測膽管癌細胞轉(zhuǎn)染層黏素受體RNA干擾質(zhì)粒前、后對Jurkat細胞凋亡的影響，并分析層黏素受體可能參與膽管癌免疫逃逸的分子機制。 本組實驗主要的結(jié)果如下： 1.用流式細胞技術(shù)成功分選出高表達層黏素受體的膽管癌細胞亞群。用HE染色觀察分選前、后兩組細胞形態(tài)學的變化。結(jié)果，兩組細胞HE染色可見，細胞體均呈圓形、橢圓形、紡錘形，偶見多角形，大小不一，折光性強；細胞膜

9、清晰、完整，核質(zhì)較大；胞核界限清楚，可見一至多個核仁，核分裂相多見。總體上看，高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群的胞體較低表達層黏素受體膽管癌細胞的胞體伸展，胞膜表面突起增多，異型性更明顯。 2.細胞骨架蛋白染色觀察，兩組膽管癌細胞質(zhì)內(nèi)清晰可見骨架蛋白(微絲、微管和中間纖維)呈藍色絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，近核側(cè)較致密，相鄰細胞間有骨架束彼此穿行。整體上看兩組細胞骨架結(jié)構(gòu)分布類似，排列較規(guī)則，而高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群細胞骨架結(jié)構(gòu)明顯紊亂，

10、斑點狀肌動蛋白小體、胞體突起及胞膜表面長絲狀結(jié)構(gòu)增多。 3.掃描電鏡和透射電鏡下，膽管癌細胞均呈大小不等的橢圓形或短梭形，但高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群的胞體表面突起較低表達層黏素受體膽管癌細胞明顯增多，片狀偽足寬厚，絲狀偽足細長而密集。 4.隨機運動實驗和侵襲實驗表明高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群的運動和侵襲能力較低表達層黏素受體膽管癌細胞明顯增強。 5.成功構(gòu)建層黏素受體RNAi質(zhì)粒，經(jīng)測序、鑒定符合實驗設(shè)

11、計要求。 6.高表達層黏素受體膽管癌細胞亞群轉(zhuǎn)染層黏素受體RNAi質(zhì)粒后，伴隨膽管癌細胞層黏素受體表達的下調(diào)，膽管癌細胞的黏附能力下降，膽管癌細胞的MMP-2、MMP-9、uPAmRNA及蛋白表達降低，而膽管癌細胞表面ICAM-1的mRNA及蛋白表達卻增加。用基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制劑(GM6001)抑制MMP-2和MMP-9的活性后，膽管癌細胞表面ICAM-1的蛋白表達較對照組明顯增加。說明膽管癌細胞層黏素受體高表達可增加MM

12、P-2、MMP-9活性，可能降解腫瘤細胞表面ICAM-1，進而逃避機體免疫細胞的殺傷，促進膽管癌細胞免疫逃逸。 7.轉(zhuǎn)染層黏素受體RNAi質(zhì)粒至高表達層黏素受體的膽管癌細胞亞群中后發(fā)現(xiàn)膽管癌的層黏素受體表達下降，與此同時，膽管癌FasL在基因和蛋白水平的表達也均隨之降低。本實驗可初步得出在膽管癌細胞中層黏素受體過表達可能與FasL的表達有內(nèi)在的聯(lián)系。 8.人Jurkat細胞與膽管癌細胞共培養(yǎng)后，Jurkat細胞的凋亡指數(shù)

13、明顯增加。層黏素受體RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膽管癌細胞能減弱膽管癌細胞誘導(dǎo)Jurkat細胞的凋亡。初步證明膽管癌細胞層黏素受體過表達可能在膽管癌細胞免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1.膽管癌細胞中層黏素受體高表達可明顯增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。 2.膽管癌細胞LNR過表達，通過分泌MMP-2、MMP-9及uPA等蛋白分子，降解膽管癌細胞表面的黏附分子(ICAM-1)等物質(zhì)，將使膽管癌細胞逃避細