層黏素受體在介導(dǎo)膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中所致內(nèi)皮細(xì)胞屏障喪失分子機(jī)制的初步探討.pdf

1、腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程。在這一過(guò)程中，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞突入或游出淋巴或血流的管壁是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。有關(guān)腫瘤細(xì)胞如何突破內(nèi)皮細(xì)胞屏障(endothelialbarrier)卻知之甚少。 細(xì)胞跨膜糖蛋白層黏素受體(lamininreceptor，LNR)，有可能在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞屏障喪失中發(fā)揮重要作用。層黏素受體是最重要的細(xì)胞黏附分子受體之一，因此我們推想，下調(diào)膽管癌細(xì)胞層黏素受體的表達(dá)，干擾膽管癌細(xì)

2、胞與內(nèi)皮細(xì)胞間信息傳遞，將有可能消除或降低膽管癌突入或游出淋巴或血循環(huán)的能力，從而達(dá)到限制轉(zhuǎn)移的目的。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：首先，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)層黏素受體在高低轉(zhuǎn)移膽管癌細(xì)胞亞群的表達(dá)，并通過(guò)設(shè)計(jì)層黏素受體反義寡核苷酸，轉(zhuǎn)染到高轉(zhuǎn)移性膽管癌細(xì)胞亞群，下調(diào)層黏素受體表達(dá)。其次，建立膽管癌細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸以及Transwell()小室旁分泌共培養(yǎng)模型，光鏡及電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞在與膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下形態(tài)改變，免疫熒光、激

3、光共聚焦技術(shù)、定量PCR、westernblot以及明膠酶譜法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞在與膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下功能的改變。最后，下調(diào)膽管癌細(xì)胞層黏素受體表達(dá)后，觀察其與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能的改變，并分析層黏素受體可能參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路。 本組實(shí)驗(yàn)主要的結(jié)果及結(jié)論如下： 1.不同膽管癌轉(zhuǎn)移亞群，層黏素受體表達(dá)存在著顯著的差別。膽管癌細(xì)胞層黏素受體高表達(dá)與其體外高侵襲性呈正相關(guān)。 2.層黏素受體反義寡核

4、苷酸轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移亞群后可下調(diào)該細(xì)胞層黏素受體的表達(dá)，且下調(diào)作用呈劑量依賴性。 3.光鏡下，膽管癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附很快，大部分黏附于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞的交界處。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與膽管癌細(xì)胞Transwell()小室共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞有形成管腔的趨勢(shì)。掃描電鏡下，膽管癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附后，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞從連接處收縮，第三軍醫(yī)大學(xué)攻讀博士學(xué)位研究生創(chuàng)新性科學(xué)研究項(xiàng)目資助編號(hào)：20031006形成間隙，暴露出下面的基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞出

5、現(xiàn)“窗口”樣孔隙。 4.膽管癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移亞群轉(zhuǎn)染層黏素受體反義寡核苷酸后，伴隨膽管癌細(xì)胞層黏素受體的下調(diào)，膽管癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力下降。 5.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞F-actin、pp125FAK表達(dá)增強(qiáng)，層黏素受體反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞能其下調(diào)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的上述作用。 6.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與膽管癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2、MMP-9、uPAmRNA及蛋白表達(dá)增加，內(nèi)皮細(xì)胞

6、分泌MMP-2、MMP-9增加。層黏素受體反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞能減弱其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的上述作用。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1.層黏素受體是介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與膽管癌細(xì)胞黏附的重要介質(zhì)。膽管癌細(xì)胞層黏素受體高表達(dá)可增強(qiáng)其與內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，促進(jìn)膽管癌轉(zhuǎn)移。 2.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞微絲肌動(dòng)蛋白在膽管癌細(xì)胞的作用下聚合與解聚，引起收縮，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間連接破壞，層黏素受體pp125FAK途徑是其重