COX-2在兔自體移植靜脈增生模型中的表達(dá)及對(duì)其干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 冠心病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,隨著國(guó)人生活和飲食習(xí)慣的改變,該病的發(fā)病率和死亡率也逐年上升。冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)是目前外科治療冠心病的主要方法,它可以明顯改善患者生活質(zhì)量和延長(zhǎng)壽命。乳內(nèi)動(dòng)脈和大隱靜脈是目前CABG的主要材料,其中大隱靜脈的使用最為常見,但術(shù)后大隱靜脈的遠(yuǎn)期通暢率并不能令人滿意。研究表明應(yīng)用大隱靜脈行CABG后第一年有12-27％的靜脈移植物閉塞,5年后其阻塞率為25-31％,以后阻塞率以每年

2、2-4％的速度增長(zhǎng),術(shù)后10年有48-66％的靜脈移植物完全阻塞,并因此有大約10％的患者需重新手術(shù)。因此,如何防治CABG術(shù)后移植靜脈再狹窄一直是學(xué)者研究的熱點(diǎn)。 環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)又名前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶,是一種膜結(jié)合蛋白,具有環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物合成酶雙重酶的功能,是體內(nèi)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(prostaglandin,PG)的關(guān)鍵酶。醫(yī)學(xué)上對(duì)COX的認(rèn)識(shí)源于對(duì)疼痛和炎癥的研究,COX是

3、炎癥的重要介質(zhì)前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶。人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),COX有兩種異構(gòu)體,即COX-1、COX-2,前者為結(jié)構(gòu)型酶,主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),參與機(jī)體正常的生理過(guò)程與功能,而后者為誘導(dǎo)型酶,多分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜,在基礎(chǔ)水平表達(dá)極低,而在炎癥等刺激情況下表達(dá)成倍增長(zhǎng)。自發(fā)現(xiàn)COX抑制劑阿司匹林對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)相關(guān)疾病有防治作用后,COX與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的同工酶COX-2成為關(guān)注的焦點(diǎn)。多年的研究證實(shí),A

4、S的病理生理過(guò)程也是一種慢性炎癥反應(yīng)的過(guò)程,其本質(zhì)為炎癥性疾病,系統(tǒng)監(jiān)測(cè)炎癥標(biāo)志物的變化已經(jīng)成為AS相關(guān)疾病現(xiàn)代防治的一大進(jìn)展。 目前,已有的研究發(fā)現(xiàn)了COX-2參與動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法對(duì)人類AS斑塊的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),AS部位血管的COX-2 mRNA表達(dá)是正常血管對(duì)照的4.8倍,而COX-1 mRNA表達(dá)僅為正常對(duì)照的1.1倍。采用免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)人類AS病變的各細(xì)胞成份均有大量COX-2蛋白表

5、達(dá),而在無(wú)AS病變的正常血管壁無(wú)表達(dá)。同時(shí),有研究發(fā)現(xiàn)COX-2不僅參與AS的形成,而且可能在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中均具有重要影響。而在研究兔動(dòng)脈球囊擴(kuò)張損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),損傷動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的COX-2 mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組,而COX-2選擇性抑制劑可抑制它的表達(dá)；并且,使用COX-2選擇性抑制劑可以減輕實(shí)驗(yàn)中血管球囊擴(kuò)張損傷后的炎癥反應(yīng)及內(nèi)膜增殖。冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)后移植靜脈的再狹窄,表現(xiàn)為移植靜脈

6、血管內(nèi)膜及平滑肌的增殖,晚期也表現(xiàn)為粥樣硬化。據(jù)此,我們假設(shè),COX-2在移植靜脈再狹窄模型中會(huì)明顯表達(dá)增高,并且,COX-2的表達(dá)與靜脈的再狹窄過(guò)程相關(guān)。據(jù)此假設(shè),我們進(jìn)行本課題的研究。 研究目的有：①以兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立穩(wěn)定的自體移植靜脈模型,證實(shí)COX-2在移植靜脈中會(huì)有明顯的表達(dá)異常；②原代培養(yǎng)出兔靜脈血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞,并可連續(xù)傳代,滿足體外實(shí)驗(yàn)需要；③建立有效的RNA干擾系統(tǒng),可在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中高效特異的抑制兔靜脈細(xì)胞C

7、OX-2的表達(dá)；④使用RNAi技術(shù)及COX-2特異性抑制劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)COX-2的表達(dá)情況與兔靜脈血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的增殖過(guò)程的相關(guān)性；⑤通過(guò)使用COX-2特異性抑制劑,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)干預(yù)COX-2的表達(dá)可以影響移植靜脈增生、狹窄的進(jìn)程。 方法： 1、研究COX-2在兔自體移植靜脈血管壁中的表達(dá)情況 取新西蘭大白兔(體重2.2～2.5kg)24只,雌雄不限,隨機(jī)分成3組,每組8只。耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉3

8、0mg/kg麻醉后,以"Cuff"套管法行單側(cè)頸外靜脈-頸總動(dòng)脈自體移植手術(shù)。術(shù)后前三天每12小時(shí)肌注青霉素20萬(wàn)U,皮下注射肝素鈉1mg/kg。三組兔分別于術(shù)后2周、8周、12周麻醉后取移植靜脈及對(duì)側(cè)頸外靜脈標(biāo)本作自身對(duì)照。每個(gè)標(biāo)本分成兩部分,一半行免疫組化染色；一半保存于液氮中,備實(shí)時(shí)定量PCR使用。研究觀察：①鏡下觀察靜脈切片免疫組化染色差異；②通過(guò)提取靜脈標(biāo)本總RNA,反轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),量化的反應(yīng)組織中COX-2的表

9、達(dá)情況。 2、兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng) 新西蘭大白兔麻醉后取下腔靜脈作為細(xì)胞培養(yǎng)組織。分離血管時(shí)盡量剝盡外膜,血管取下后快速使用37℃預(yù)熱的生理鹽水漂洗盡血液,暫存于37℃無(wú)血清培養(yǎng)基中,移至無(wú)菌操作臺(tái)。擬行平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的靜脈血管,先將其翻轉(zhuǎn)后置于0.1％I型膠原酶中,37℃孵育20分鐘后充分漂洗,去除內(nèi)皮細(xì)胞,將血管剪成長(zhǎng)約1～2mm的小段,再沿血管縱向?qū)⑵浼舫蓛砂?將血管面展開后行貼塊法培養(yǎng),培養(yǎng)基為M199(

10、含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/mI)。擬行內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的靜脈血管,直接將其剪成長(zhǎng)約1～2mm的小段,再沿血管縱向?qū)⑵浼舫蓛砂?將血管面展開后行貼塊法培養(yǎng),培養(yǎng)基為RPMI-1640(含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、肝素100μg/ml、胰島素100μg/ml、氫化可的松100μg/ml)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)后根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察確定為平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)行a平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA

11、)及Ⅷ因子免疫組化方法鑒定其來(lái)源。 3、體外干預(yù)兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞COX-2的表達(dá),觀察其對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的影響 首先,應(yīng)用EGFP報(bào)告基因體外篩選干擾兔COX-2較有效的siRNA位點(diǎn)；然后,使用選出的siRNA片段及已知的COX-2抑制劑NS-398體外干預(yù)兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞COX-2的表達(dá),檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。檢測(cè)指標(biāo)有：①免疫組化染色；②MTT法測(cè)細(xì)胞數(shù)；③流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期；④流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；

12、⑤實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)COX-2 mRNA的表達(dá)情況；⑥免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)COX-2、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)情況。 4、COX-2抑制劑對(duì)兔自體移植靜脈血管壁重構(gòu)的影響 取新西蘭大白兔(體重2.2～2.5kg)48只,雌雄不限。隨機(jī)分成3組,每組16只,每組兔子再隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組兩組,每組8只。均行自體頸外靜脈-頸總動(dòng)脈移植手術(shù)。術(shù)后前三天每12小時(shí)肌注青霉素20萬(wàn)U,皮下注射肝素

13、鈉1mg/kg,實(shí)驗(yàn)組每日灌胃給予COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(Celecoxib)-次,劑量為5mg/kg。三組兔分別于術(shù)后2周、8周、12周麻醉后取移植靜脈檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)本分成兩部分,一半行免疫組化染色；一半保存于液氮中,備實(shí)時(shí)定量PCR使用。檢測(cè)指標(biāo)有：①HE、VB染色,光鏡下測(cè)量血管壁內(nèi)膜、中膜厚度；②免疫組化染色觀察不同組靜脈陽(yáng)性染色程度差異；③提取標(biāo)本總RNA,反轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),量化比較各組COX-2mRNA表達(dá)的差異

14、。 結(jié)果： 1、證實(shí)COX-2在移植靜脈中表達(dá)明顯增高鏡下觀察免疫組化切片標(biāo)本發(fā)現(xiàn),正常靜脈無(wú)明顯陽(yáng)性染色,而三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的移植靜脈切片標(biāo)本均呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)顯示,移植靜脈中COX-2mRNA表達(dá)明顯增高。 2、成功培養(yǎng)出兔靜脈內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞,并可連續(xù)傳代先行消化去內(nèi)皮細(xì)胞的靜脈血管,通過(guò)貼塊法使用M199(含20％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml)培養(yǎng),5天左右可見組織周圍

15、有長(zhǎng)梭形細(xì)胞爬出,9天左右細(xì)胞成片生長(zhǎng),呈單層束狀,排列緊密。 3、證實(shí)在體外抑制COX-2的表達(dá)可抑制兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的增殖本部分實(shí)驗(yàn)成功篩選出有效的兔COX-2干擾位點(diǎn)。使用RNA干擾及COX-2抑制劑體外抑制COX-2的表達(dá)。 4、證實(shí)使用COX-2抑制劑可以影響兔自體移植靜脈血管壁增殖的進(jìn)程取各時(shí)間點(diǎn)移植靜脈標(biāo)本行HE、VB染色,光鏡下測(cè)量血管壁內(nèi)膜及中膜厚度。 結(jié)論： 1、COX-2在正常

16、靜脈中呈低表達(dá),而在動(dòng)脈化的移植靜脈中呈明顯的高表達(dá)。 2、建立簡(jiǎn)單有效的原代培養(yǎng)兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的方法,且所得細(xì)胞可以連續(xù)傳代,滿足實(shí)驗(yàn)所需。 3、應(yīng)用EGFP報(bào)告基因可在體外成功篩選干擾兔COX-2的較有效siRNA位點(diǎn)。 4、體外使用RNA干擾技術(shù)及COX-2特異性抑制劑NS-398均可抑制兔靜脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞COX-2 mRNA的表達(dá),并可抑制靜脈細(xì)胞增殖。 5、使用COX-2抑制劑可誘導(dǎo)