內(nèi)毒素結(jié)合蛋白CRISPLD2在膿毒癥中的表達(dá)及其意義.pdf

1、膿毒癥是危重癥患者常見(jiàn)并發(fā)癥，其病理生理過(guò)程復(fù)雜，牽涉全身各個(gè)器官。盡管各類廣譜抗生素的應(yīng)用，新的治療方法不斷出現(xiàn)，膿毒癥患者死亡率依然居高不下，是困擾急診和重癥醫(yī)學(xué)醫(yī)生的重大難題。重組活化蛋白C(drotrecoginalfa.arecombinantactivatedproteinC)以及eritorantetrasodium(anovelanti-Toll-likereceptor(TLR)-4compound)雖然在1期和2期臨

2、床試驗(yàn)證實(shí)有效，最近的3期臨床實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)明確的治療效果，重要的原因就是缺少合適的標(biāo)志物分層，判斷哪些患者受益于治療。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物對(duì)于診斷和治療膿毒癥非常重要。
　　 導(dǎo)師組王志勤教授等前期工作發(fā)現(xiàn)半胱氨酸富集的分泌蛋白含有兩個(gè)LCCL結(jié)構(gòu)域(CRISPLD2/Crispld2)，亦是內(nèi)毒素結(jié)合蛋白，具有很好的結(jié)合內(nèi)毒素的親和力。內(nèi)毒素同CRISPLD2的親和力同CD14、MD2近似，高于TLR4，低于LBP。體內(nèi)

3、發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素刺激外周單個(gè)核細(xì)胞能夠促進(jìn)CRISPLD2的分泌，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示內(nèi)毒素腹腔注射后24小時(shí)內(nèi)CRISDPLD2蛋白水平下降，24小時(shí)后迅速反彈，5-7天到達(dá)高峰，隨后緩慢下降，維持2周左右。而重組CRISPLD2蛋白抑制內(nèi)毒素同靶細(xì)胞結(jié)合，減輕炎癥反應(yīng)，降低TNF-a和IL-6的水平，保護(hù)內(nèi)毒素休克小鼠。人血清(漿)CRISPLD2水平高于LBP，solubleCD14等。值得注意的是嬰兒臍帶血CRISPLD2水平明顯低于成年人。

4、總之，CRISPLD2在膿毒癥病理生理過(guò)程中起著重要作用。以往的研究使用LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克模型，并沒(méi)有反映真正的多種細(xì)菌感染的臨床狀態(tài)，盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型已被廣泛用于實(shí)驗(yàn)性研究，并且被認(rèn)為是模仿人類多種細(xì)菌感染造成的膿毒癥一個(gè)可靠的模型。盲腸結(jié)扎的范圍、穿刺針孔大小及穿刺次數(shù)等可以制作不同程度的膿毒癥，死亡率亦有很大差別。最近發(fā)現(xiàn)CRISPLD的R3H結(jié)構(gòu)域，可以與寡核苷酸綁定在一起，已有實(shí)驗(yàn)證明CpG寡核苷酸(ssC

5、pGDNA)可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免于細(xì)菌感染。我們研究發(fā)現(xiàn)，CRISPLD2包含一個(gè)RAAIH(R3H)結(jié)構(gòu)，目前還沒(méi)有資料表明CRISPLD2是否結(jié)合單鏈DNA。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid)受體可以和CRISPLD2基因啟動(dòng)區(qū)特定DNA序列(GRE)結(jié)合。
　　 基于上述背景，我們提出以下假設(shè)：CRISPLD2也是一個(gè)ssDNA結(jié)合蛋白，多種微生物抗原促進(jìn)CRISPLD2分泌；上調(diào)血清CRISPLD2水平保護(hù)膿毒癥老鼠

6、(CLP)；糖皮質(zhì)激素調(diào)控CRISPLD2表達(dá)，可能與糖皮質(zhì)激素保護(hù)膿毒癥的作用機(jī)制相關(guān)；CRISPLD2可能成為臨床膿毒癥患者新的生物標(biāo)志物。
　　 本研究的第一部分，我們證實(shí)CRISPLD2不僅是一個(gè)內(nèi)毒素結(jié)合蛋白亦是一個(gè)單鏈DNA結(jié)合蛋白，多種微生物抗原如ssCPG-DNA、PGN、ssGPC-DNA和雙鏈RNA
　　 (PolyI：C)等可以刺激外周單個(gè)核細(xì)胞分泌CRISPLD2；CRISPLD2與內(nèi)毒素結(jié)合抑制

7、后者同靶細(xì)胞結(jié)合，而其與單鏈DNA的結(jié)合并不阻斷后者與靶細(xì)胞結(jié)合。
　　 本研究的第二部分，我們利用膿毒癥盲腸結(jié)扎穿孔動(dòng)物模型探討CRISPLD2在膿毒癥中的表達(dá)規(guī)律及以其為靶點(diǎn)治療膿毒癥的可行性。膿毒癥大鼠急性期的高死亡率同過(guò)度的炎癥反應(yīng)以及CRISPLD2的未能及時(shí)上調(diào)相關(guān)。預(yù)注射內(nèi)毒素可以上調(diào)CRISPLD2水平，同降低膿毒癥小鼠的死亡率相關(guān)。重組CRISPLD2蛋白的靜脈注射上調(diào)血清CRISPLD2水平，降低膿毒癥死亡率

8、。糖皮質(zhì)激素上調(diào)正常大鼠CRISPLD2水平，小劑量糖皮質(zhì)激素上調(diào)膿毒癥大鼠CRISPLD2水平同降低膿毒癥大鼠死亡率相關(guān)，中到大劑量糖皮質(zhì)激素未能提高血清CRISPLD2水平，未能降低膿毒癥大鼠死亡率。
　　 本研究的第三部分，我們首先檢測(cè)CRISPLD2的表達(dá)情況，正常水平為221.39±61.50ug/ml，在膿毒癥時(shí)其水平明顯上升，而在感染性休克時(shí)其水平上升受到限制，顯著低于正常水平及膿毒癥患者水平。在膿毒癥患者中，CR

9、ISPLD2水平同病情程度評(píng)分APACHEII及SOFA明顯相關(guān)，同炎癥指標(biāo)PCT相關(guān)。
　　 綜上所述：CRISPLD2不僅是一個(gè)內(nèi)毒素結(jié)合蛋白，亦是一個(gè)ssCPG-DNA結(jié)合蛋白；在膿毒癥大鼠CLP模型中，嚴(yán)重的感染伴隨低水平CRISPLD2與高死亡率相關(guān)；通過(guò)腹腔預(yù)注射內(nèi)毒素或者靜脈注射重組CRISPLD2，提高血清CRISPLD2水平，與降低膿毒癥小鼠死亡率相關(guān)；糖皮質(zhì)激素調(diào)控大鼠CRISPLD2水平，小劑量激素促進(jìn)CR