囊胚冷凍及凍融過(guò)程對(duì)人類囊胚超微結(jié)構(gòu)影響研究.pdf

1、目的(1)通過(guò)小鼠囊胚冷凍實(shí)驗(yàn)，探討不同的冷凍方法對(duì)小鼠囊胚冷凍效果的影響；通過(guò)小鼠囊胚的玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)，探討用半麥管為載體，冷凍液中添加高濃度的血清對(duì)提高玻璃化冷凍效果的價(jià)值；觀察小鼠囊胚玻璃化冷凍前用激光行輔助皺縮對(duì)囊胚凍融效果的影響；觀察小鼠囊胚玻璃化凍融后對(duì)囊胚發(fā)育能力及著床能力的影響；(2)通過(guò)人囊胚的冷凍實(shí)驗(yàn)，比較不同的冷凍方法對(duì)人囊胚凍存效果的影響；通過(guò)透射電鏡對(duì)凍融后人囊胚超微結(jié)構(gòu)的觀察，了解凍融過(guò)程對(duì)人囊胚超微結(jié)構(gòu)的影

2、響，為以后人類輔助生殖技術(shù)中冷凍方法的改進(jìn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法(1)用清潔級(jí)成年健康ICR小白鼠，雌鼠90只，雄鼠30只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，獲取小鼠囊胚，慢速程序冷凍或用半麥管、平皿為載體行玻璃化冷凍，凍融后的鼠囊胚做體內(nèi)移植，觀察產(chǎn)仔情況；觀察激光輔助皺縮對(duì)擴(kuò)張期鼠囊胚玻璃化冷凍的影響；(2)獲取體外受精一胚胎移植患者多精或質(zhì)量差胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)使其發(fā)育成囊胚，隨機(jī)分成玻璃化冷凍組和慢速程序冷凍組，觀察不同冷凍方法對(duì)人囊胚冷凍效果的影響

3、，另獲取優(yōu)質(zhì)囊胚18枚，隨機(jī)分為新鮮囊胚對(duì)照組、慢速凍融組和玻璃化凍融組，每組選取3枚胚胎固定切片，電鏡觀察凍融對(duì)人囊胚超微結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果1．半麥管法與平皿一微滴法相比，兩組胚胎解凍后囊胚回收率分別是半麥管組94。7％，平皿組95．5％；存活率半麥管組60．6％，平皿組57．8％；孵出率半麥管組37．2％，平皿組37．8％。兩組比較差異無(wú)顯著性(P>O．05)；半麥管玻璃化冷凍方法與慢速程序冷凍方法相比，胚胎回收率分別為：半

4、麥管組94．7％，程序組100％：胚胎存活率半麥管組60．6％，程序組54．3％；囊胚孵出率：半麥管組37．2％，程序組35．5％。兩組相比，差異無(wú)顯著性(P>0．05)；冷凍保護(hù)液中添加高濃度小牛血清后，囊胚的擴(kuò)張和孵化率都明顯高于未添加小牛血清組，但兩組相比，差異無(wú)顯著性意義(P>O．05)。完全擴(kuò)張期囊胚玻璃化冷凍前行激光輔助皺縮后，解凍后囊胚全部退化。選用玻璃化凍融后擴(kuò)張良好的小鼠囊胚19枚，移植到2只D4代孕母鼠子宮內(nèi)，1只代

5、孕母鼠成功妊娠，共產(chǎn)仔4只。2．總的67枚人囊胚，隨機(jī)分成兩組，半麥管玻璃化冷凍組34枚(簡(jiǎn)稱半麥管組)，慢速程序冷凍組33枚，解凍后見(jiàn)囊胚腔擴(kuò)張，囊胚存活數(shù)為半麥管組19枚(存活率55。9％)，慢速程序組21枚(存活率63．6％)；囊胚孵出數(shù)半麥管組9枚(孵出率47．4％)，慢速程序冷凍組12枚(孵出率57．1％)。兩組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。經(jīng)過(guò)冷凍后在光學(xué)顯微鏡下看起來(lái)發(fā)育良好的胚胎，切片后用透射電子顯微鏡觀察，可見(jiàn)透

6、明帶變平滑，線粒體膜和嵴的部分損壞，胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)破壞的線粒體殘留體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、微絨毛結(jié)構(gòu)及細(xì)胞問(wèn)連接均受到不同程度的損傷，甚至在胚胎內(nèi)有退化、死亡的細(xì)胞。 結(jié)論1．用半麥管作為冷凍載體使玻璃化冷凍操作更簡(jiǎn)單、快捷，貯藏更方便：用半麥管為載體小鼠囊胚玻璃化冷凍與程序慢速冷凍取得相似的效果，但玻璃化冷凍費(fèi)時(shí)少，花費(fèi)小，操作更簡(jiǎn)單。在玻璃化冷凍液中添加高濃度的小牛血清能提高凍融后囊胚重新擴(kuò)張存活的能力。用激光行小鼠囊胚玻璃化冷凍前