囊胚培養(yǎng)技術

1、囊胚培養(yǎng)技術進展,,受精卵一旦形成，隨即啟動卵裂機制。在第3、4天時受精卵已分裂為約100個細胞的內(nèi)細胞團。經(jīng)輸卵管蠕動細胞團被送入子宮腔，通過表面粘性物，貼附與子宮內(nèi)膜，靠近子宮內(nèi)膜的細胞分泌一種酶，將子宮內(nèi)膜細胞裂解，形成一個小洞，從受精后的5、6天開始至第11、12天，整個胚泡埋入內(nèi)膜，該過程稱為“著床”或“植入“。胚泡植入后，子宮內(nèi)膜重新長好，胚泡表面的滋養(yǎng)層細胞不斷分裂，長出絨毛狀突起，形成許多絨毛，伸入子宮內(nèi)膜，吸收母體營

2、養(yǎng),胚胎培養(yǎng)：將卵泡液中撿出的成熟卵細胞洗滌后，置于含人血清白蛋白的授精液中，于37℃、體積分數(shù)為5％的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后授精。授精后16-18 h轉(zhuǎn)移入卵裂培養(yǎng)液中，觀察受精情況，記錄原核情況。第3天時觀察胚胎的發(fā)育情況，記錄胚胎的卵裂球數(shù)及分級。囊胚培養(yǎng)：胚胎移入預先平衡好的囊胚培養(yǎng)液中，于37℃、體積分數(shù)為5％的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后觀察囊胚形成情況。,胚胎早期培養(yǎng),發(fā)育阻斷,在離體培養(yǎng)哺乳類（包括人）受

3、精卵時人們發(fā)現(xiàn)，在一些化學成分確定的培養(yǎng)基中，受精卵往往不能發(fā)育到囊胚，而是停頓在某個特定的發(fā)育時期。這種現(xiàn)象被稱作“發(fā)育阻斷”。發(fā)育阻滯的時期隨物種不同而異，例如，大鼠和小鼠的發(fā)育阻滯發(fā)生在2細胞期以后，人發(fā)生在4-8細胞期，牛、羊等發(fā)生在8-16細胞期，兔發(fā)生在桑葚胚期。,普通胚胎移植大多數(shù)試管嬰兒中心選擇第3天胚胎來移植，胚胎已發(fā)育到8細胞。在IVF中，囊胚培養(yǎng)是“胚胎體外培養(yǎng)”的終末階段，它通常形成于卵子受精后的第5-

4、6天。自然生理狀態(tài)下，早期胚胎在輸卵管中發(fā)育，直到接近囊胚期才進入子宮。因此，利用體外培養(yǎng)技術將胚胎培養(yǎng)至囊胚期再植回子宮腔，能獲得較高的胚胎植入率。,囊胚移植的優(yōu)勢,(1)使胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜/種植窗同步,更符合生理著床時間,從而提高IVF-ET的胚胎種植率,同時可提高臨床妊娠率并減少胚胎移植數(shù)量,進一步降低多胎妊娠率;(2)進一步淘汰具有遺傳缺陷、無發(fā)育潛能的胚胎,使可供移植的胚胎得到篩選;(3)縮短了胚胎移植入子宮腔后進一步發(fā)

5、育與著床之間的間隔,且子宮收縮逐漸減少,可減少胚胎排出體外的機會,有利于胚胎著床;,(4)為分裂期胚胎活檢,進入植入前遺傳學診斷(PGD)提供時間,另外,可直接對囊胚的滋養(yǎng)層細胞進行活檢,由于提供了較多的細胞來源,進而提高了診斷的準確性;(5)為人胚胎胚胎干細胞技術研究提供細胞來源。因此,囊胚培養(yǎng)和單囊胚移植已成為許多生殖中心提高妊娠率,并降低多胎發(fā)生率的重要手段之一。,,,囊胚培養(yǎng)技術的發(fā)展,共培養(yǎng)技術及作用機理,共培養(yǎng)：是指在胚胎

6、體外發(fā)育的培養(yǎng)液中加入一些體細胞作為營養(yǎng)細胞與胚胎一起培養(yǎng)，如輸卵管上皮細胞或子宮上皮細胞共同培養(yǎng)等，建立共培養(yǎng)體系以促進胚胎發(fā)育，克服胚胎體外發(fā)育阻斷，提高胚胎移植率。第一，在胚胎發(fā)育過程中能自分泌或旁分泌一些對早期胚胎有利的物質(zhì)，研究最多的是生長因子；第二，共培養(yǎng)體系可代謝降解或除去培養(yǎng)液中胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的胚胎毒性因子，如銨、次黃嘌呤和氧自由基等等；第三，共培養(yǎng)細胞可能通過體細胞與胚胎的直接接觸促進胚胎發(fā)育。,輸卵管上皮細

7、胞共培養(yǎng)技術,卵母細胞由卵巢排出后在輸卵管壺腹部受精形成受精卵，輸卵管可以分泌活性因子刺激胚胎發(fā)育，因此使用輸卵管上皮細胞特別是輸卵管壺腹部上皮與早期胚胎進行共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的自然環(huán)境， 有利于早期胚胎的生長發(fā)育，使更多的胚胎發(fā)育至囊胚階段。人輸卵管上皮細胞是最早應用于臨床的共培養(yǎng)細胞，1989 年 Bongso 等報道，利用人輸卵管上皮與人胚胎共培養(yǎng)提高囊胚形成率。 Khatir 等的研究顯示，輸卵管上皮細胞共培養(yǎng)比顆粒細胞共

8、培養(yǎng)更適合體外胚胎發(fā)育。,子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)技術,胚胎在輸卵管發(fā)育很短時間后進入子宮，子宮是胚胎發(fā)育的最終場所，因此亦有許多胚胎共培養(yǎng)體系以子宮內(nèi)膜細胞為輔助細胞。 子宮內(nèi)膜可以分泌許多活性因子，如白血病抑制因子（LIF）、表皮生長因子（EGF）及許多細胞因子和黏附分子，這些物質(zhì)均能有效提高胚胎的發(fā)育率和質(zhì)量。研究顯示，利用人自體子宮內(nèi)膜細胞 （含基質(zhì)細胞和上皮細胞） 做飼養(yǎng)層與人 IVF 胚胎共培養(yǎng)與其在傳統(tǒng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)相比，胚胎

9、細胞數(shù)顯著增加，胞質(zhì)碎片率明顯下降，培養(yǎng)至囊胚階段胚胎數(shù)增加，種植率和妊娠率提高。動物試驗還顯示，子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)可增加囊胚內(nèi)細胞團的細胞數(shù)， 減少細胞凋亡，從細胞生物學水平證明共培養(yǎng)可以提高胚胎發(fā)育潛力。最近有研究顯示，子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)比序貫培養(yǎng)能提高囊胚形成率、胚胎種植率和臨床妊娠率。 說明共培養(yǎng)體系可以在體外為胚胎發(fā)育提供一種更類似于體內(nèi)的環(huán)境。,卵丘細胞共培養(yǎng)技術,卵母細胞調(diào)節(jié)顆粒細胞的新陳代謝，而其所需的營養(yǎng)物質(zhì)依賴卵

10、丘細胞提供，兩者間還通過縫隙連接進行信號傳導，進而調(diào)節(jié)卵母細胞的生長和成熟。應用自體卵丘細胞與 IVF 得到的早期胚胎共培養(yǎng)，可改善胚胎質(zhì)量，提高妊娠率。顆粒細胞：卵泡(follicle)中卵母細胞四周有一層菱形或扁平細胞圍繞，在卵泡開始發(fā)育、卵細胞成長的同時，周圍的菱形細胞變?yōu)榱⒎叫?，并由單層增生成復?①顆粒細胞進入宮腔后繼續(xù)分泌生長因子輔助胚胎著床。②顆粒細胞生長發(fā)育形成樹枝狀結(jié)構(gòu)固定胚胎，增加胚胎在宮腔內(nèi)的黏著性。,Par

11、ikh 等首次應用顆粒細胞共培養(yǎng)-共移植技術，將一定數(shù)量的共培養(yǎng)的顆粒細胞和胚胎一起移植入子宮，提高了種植率、妊娠率和多胎率。Ebner 等改變了在行胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）前去除卵子周圍全部顆粒細胞的傳統(tǒng)方法，而在 ICSI 時保留部分顆粒細胞共培養(yǎng)，改善胚胎質(zhì)量，提高囊胚形成率，該項研究從另一種角度證實顆粒細胞在胚胎發(fā)育過程中的不可或缺的重要作用。顆粒細胞共培養(yǎng)體系促進胚胎體外發(fā)育的作用已得到肯定，但卵丘細胞共培養(yǎng)的效果受諸

12、多因素的影響，如卵丘細胞密度、成熟度等。,序貫培養(yǎng),序貫培養(yǎng)是按照體外培養(yǎng)胚胎在不同發(fā)育時期代謝需求不同,配制成階段系列培養(yǎng)液,進行序列更換,從而延長胚胎在體外的培養(yǎng)時間。培養(yǎng)流程:d 0日使用HTF液+10%人血清(HS)進行培養(yǎng),d 1日觀察受精情況,更換P1液+10% HS,若受精卵數(shù)3個則更換Blasto-cyst液(B液) +10%HS,培養(yǎng)至d 5日(授精后90~96 h)選取擴張囊胚(囊胚腔>1/2胚胎體積)移植。

13、所用培養(yǎng)液均于使用前1 d配制,放入37℃、5%二氧化碳條件下平衡過夜。優(yōu)質(zhì)胚胎判斷標準:卵裂球規(guī)整,胞質(zhì)均勻細膩,無核碎片<10%。,胚胎從受精卵至2-4細胞階段,以消耗丙酮酸為主,在無糖及磷酸鹽條件下發(fā)育得更好;卵裂球擠緊以后,其代謝模式由三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?需要培養(yǎng)液中糖的存在。HTF液是按照輸卵管液成分配制的簡單培養(yǎng)液,含葡萄糖、磷酸鹽、丙酮酸鈉與乳酸鈉;P1液為不含糖與磷酸根離子、含丙酮酸鈉與乳酸鈉的簡單培養(yǎng)液;

14、B液為含糖、多種氨基酸與維生素的復雜培養(yǎng)液。由于序貫培養(yǎng)換液次數(shù)多,受外界環(huán)境影響大,污染機會相對較多,故必需有嚴格的實驗室質(zhì)控程序與無菌操作做基礎,盡可能減少對胚胎的影響。,貫序聯(lián)合子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng),囊胚培養(yǎng)液與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞聯(lián)合培養(yǎng)。聯(lián)合培養(yǎng)前 將子宮內(nèi)膜細胞接種于 培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當細胞達到 80% －90% 融合后，將子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)液換成已配制好且經(jīng)過平衡過夜 的 囊 胚 培 養(yǎng) 液。再將D3 胚胎置于融合后的內(nèi)膜細胞上，

15、培養(yǎng)液每 48h 更換。,廢棄胚胎體外培養(yǎng)仍能發(fā)育至囊胚階段; 序貫聯(lián)合子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)的方法，與單純的體外序貫培養(yǎng)相比，其囊胚形成率更高，是進行廢胚繼續(xù)體外培養(yǎng)的更有效方法.分析原因可能在于:①子宮內(nèi)膜細胞可分泌一些生長因子和蛋白等，如白細胞介素 ( IL - 1、6等)、胰島素生長因子(IGF)等，對早期胚胎生長發(fā)育有利。②共培養(yǎng)系統(tǒng)可以代謝降解胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，如螯合重金屬離子、銨、次黃嘌呤和氧自由基等，使胚胎得

16、以更好發(fā)育。③將胚胎與子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)，更接近體內(nèi)胚胎自然生長環(huán)境，使胚胎能夠更好的接受各種旁分泌和自分泌信號的調(diào)節(jié)。④序貫培養(yǎng)為不同發(fā)育時期的胚胎提供適合其代謝需求的培養(yǎng)液，結(jié)合子宮內(nèi)膜細胞為胚胎發(fā)育提供的促生長因子及生理環(huán)境，并減少胚胎發(fā)育中的不利因素，二者聯(lián)合應用，為胚胎體外發(fā)育提供更多有利條件。,子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)聯(lián)合序貫成組培養(yǎng)對人早期冷凍時限較長的胚胎發(fā)育具有積極的支持作用，可為充分利用寶貴資源進行胚胎實驗室質(zhì)控、胚胎干細

17、胞研究等領域提供支持性方案。,囊胚培養(yǎng)的缺點,囊胚培養(yǎng)要求條件高，由于實驗室培養(yǎng)條件或胚胎自身原因，胚胎可能會停止發(fā)育或退化，導致沒有胚胎可移植。不能浪費較多的卵裂期胚胎：由于體外培養(yǎng)環(huán)境終究不是體內(nèi)自然環(huán)境，延長培養(yǎng)時間，可能使一部分能夠著床的卵裂期胚胎退化。,適宜人群,如染色體異常患者等需要做胚胎活檢的患者，在完成活檢后，進行囊胚培養(yǎng)的同時等待PGD結(jié)果。因為某些原因而需要暫緩胚胎移植，但是依然希望能夠移植新鮮胚胎的患者，就可以