介入栓塞聯(lián)合三氧化二砷對肝癌侵襲轉移潛能的影響及其機制的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分
　　缺氧對肝癌細胞轉移能力及上皮間質轉化影響的實驗研究
　　目的:
　　目前肝動脈化療栓塞(TACE)已經成為不能手術切除肝癌的標準治療，但是TACE后殘存癌細胞處于缺氧環(huán)境中，其分子生物學特性會發(fā)生改變。本研究利用大鼠肝癌細胞株McA-RH7777，通過氯化鈷(CoCl2)誘導缺氧，研究體外缺氧對肝癌細胞遷移及侵襲能力影響，并探索其相關分子機制。
　　方法:

2、r>　　利用本實驗室前期建立的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的McA-RH7777細胞株，分別以不同濃度的CoCl2誘導缺氧后進行培養(yǎng)，通過CCK-8法確定有效的藥物濃度。采用Transwell實驗研究缺氧對肝癌細胞侵襲能力的影響，并通過劃痕實驗研究缺氧條件下細胞遷移能力的變化。通過Western blot分析細胞缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和上皮間質轉化(EMT)相關分子標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的

3、變化，實時定量PCR進一步檢測EMT調控轉錄因子Twist和SnailmRNA水平差異。
　　結果:
　　100μmol/L CoCl2處理24h能誘導缺氧條件，HIF-1α表達水平升高，但是McA-RH7777細胞增殖和凋亡無顯著影響。Transwell實驗結果顯示缺氧組通過Matrigal膜的細胞數(shù)為30.2±2.46，較對照組(20.4±1.89)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。劃痕實驗顯示缺氧條件下細胞

4、劃痕修復能力較對照組明顯增加。缺氧細胞上皮分子E-cadherin表達減少，而N-cadherin、Vimentin等間質分子表達增多，提示缺氧條件下肝癌細胞EMT的發(fā)生。缺氧后肝癌細胞TwistmRNA水平增加，與對照組比較，mRNA水平差異有統(tǒng)計學意義。而Snail mRNA水平與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　體外缺氧能引起Twist轉錄因子水平增加，誘導肝癌細胞發(fā)生EMT，從而促進細胞運動及侵襲能力的

5、增加。
　　第二部分
　　三氧化二砷抑制缺氧誘導的肝癌細胞上皮間質轉化及其機制的實驗研究
　　目的:
　　三氧化二砷(ATO)對包括急性早幼粒細胞白血病在內的多種腫瘤均具有一定的殺傷作用，最近發(fā)現(xiàn)在肝癌的治療中亦有一定療效。本部分實驗研究體外缺氧和常規(guī)培養(yǎng)條件下ATO對大鼠肝癌McA-RH7777細胞侵襲、轉移能力的影響以及機制。
　　方法:
　　利用本實驗室建立的穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的肝癌細胞株，研

6、究ATO對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。以氯化鈷(CoCl2)誘導體外缺氧條件，通過劃痕實驗和Transwell實驗分別研究ATO在體外缺氧條件下對腫瘤細胞的侵襲能力的影響。免疫熒光及Western blot進一步分析ATO處理后細胞上皮間質轉化(EMT)相關分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達水平的變化，研究ATO對缺氧誘導的EMT及其調節(jié)因子Twist的影響。
　　結果:
　　ATO對McA-

7、RH7777大鼠肝癌細胞增殖有抑制作用，能引起不同程度的細胞凋亡，呈明顯的時間和劑量依賴關系。低濃度ATO(2μmol/L)作用24h對細胞增殖和凋亡影響作用不顯著，但是能明顯抑制細胞的遷移和侵襲能力。對于缺氧引起的肝癌細胞遷移和侵襲能力增加，ATO有明顯的抑制作用。免疫熒光及Western blot結果顯示，與對照組細胞相比，缺氧細胞的胞膜E-cadherin表達減少，N-cadherin表達增加。ATO處理后能上調缺氧細胞E-cad

8、herin的表達，抑制缺氧細胞發(fā)生EMT。同樣對于缺氧后細胞胞膜及核內Twist表達的增加，ATO有明顯的抑制作用。
　　結論:
　　ATO能誘導McA-RH7777大鼠肝癌細胞凋亡，抑制細胞的增殖，呈明顯的時間和劑量依賴效應。低濃度ATO能下調Twist表達抑制缺氧誘導的EMT，從而抑制缺氧條件下肝癌細胞侵襲轉移能力的增加。
　　第三部分
　　介入栓塞聯(lián)合三氧化二砷對大鼠肝癌轉移的影響及其機制的實驗研究

9、　　目的:
　　本實驗通過肝癌動物模型研究經導管動脈栓塞(TAE)對肝細胞肝癌(HCC)轉移潛能潛能的影響，并進一步研究TAE術后聯(lián)合應用ATO對HCC侵襲和轉移的影響。
　　方法:
　　將McA-RH7777大鼠肝癌細胞種植于Buffalo大鼠皮下成瘤，然后應用皮下瘤組織塊建立大鼠原位肝腫瘤模型40只。將大鼠隨機分為4組:TAE+ATO組、TAE組、ATO組和對照組。TAE術在建模后14天進行，采用逆行胃十二指腸插管

10、，注入超液化碘油（0.2 ml/kg）與生理鹽水的混懸液（碘油∶生理鹽水=1∶2）。ATO在TAE術后3天開始按2 mg/kg腹腔內注射，每天一次，每次按2 mg/kg體重給藥，連續(xù)應用5天后改為每周3次，術后2周停止給藥。以生理鹽水作為栓塞劑和藥物的陰性對照。干預治療前后定期行MRI檢查，評價肝內腫瘤的生長情況。TAE術后14天取各組5只大鼠行病理組織學檢查。通過熒光顯像觀察肺部轉移情況，殘癌細胞分子水平的變化則通過Western b

11、lot和免疫組化評估。各組剩余大鼠隨訪肝功能變化并進行生存分析。
　　結果:
　　肝臟腫瘤移植術后14天，MRI檢查顯示40只大鼠肝內均可見腫瘤生長，成瘤率100％。肝臟腫瘤在T1WI上呈低信號，在T2WI上呈高信號。T2WI顯示肝臟腫瘤平均直徑8.16±0.09 mm，腫瘤平均體積201.80±7.68 mm3。TAE能明顯抑制肝臟腫瘤的生長，但是肺轉移明顯高于對照組，殘癌組織發(fā)生上皮間質轉化(EMT)，E-cadheri

12、n表達降低，N-cadherin、Vimentin表達增加。聯(lián)合使用ATO腹腔注射能明顯抑制TAE后EMT的發(fā)生，減少肺轉移。Western blot和免疫組化結果顯示ATO能抑制EMT調節(jié)轉錄因子Twist的表達。
　　結論:
　　TAE術后缺氧引起殘癌細胞發(fā)生EMT，導致HCC的轉移潛能增加，而ATO能抑制TAE后殘癌侵襲和轉移的增加，其機制可能是通過抑制轉錄因子Twist的激活從而抑制EMT的發(fā)生。TAE后聯(lián)合ATO具