三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷機(jī)制的研究.pdf

1、本文以胃癌細(xì)胞系MGC803、BCG823、SGC7901為模型，研究As<,2>O<,3>對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷過程中線粒體途徑相關(guān)的活性氧、Bcl-2家族及凋亡抑制蛋白家族中的Survivin在此過程中的作用及在凋亡與壞死兩種不同殺傷機(jī)制中的差異，進(jìn)一步明確As<,2>O<,3>對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷機(jī)制，為在臨床中更好應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 研究材料與方法： 1.采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，繪制增殖曲線。 2.采用瑞氏-姬姆薩染色，

2、光學(xué)顯微鏡下觀察As<,2>O<,3>誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞死亡時(shí)的形態(tài)學(xué)變化。 3.采用流式細(xì)胞儀通過PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期解析及凋亡判定。 4.采用western blot檢測(cè)Bcl-2、Survivin及caspase-3蛋白的表達(dá)。 5.采用DiOC 6(3)單染法檢測(cè)線粒體跨膜電位(△ψm)的變化。采用羅丹明和碘化丙啶雙染法檢測(cè)線粒體跨膜電位(△ψm)改變與細(xì)胞存活狀念的關(guān)系。應(yīng)用流式細(xì)胞儀通過2′，7′-

3、二氯乙酰乙酸鹽熒光素標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，采用學(xué)生t檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.As<,2>O<,3>呈時(shí)間、濃度依賴性抑制胃癌MGC803、BCG823、SGC7901細(xì)胞的增殖，72h抑制細(xì)胞增殖50％的藥物濃度(ICso)分別為2.8、3.1、10.2uM，MGC803、BCG823、SGC7901細(xì)胞的活性氧水平在未用藥時(shí)活性氧峰值水平分別為20、64

4、．3、57.6，5uM As<,2>O<,3>作用24h后三種細(xì)胞系活性氧峰值水平分別為100.8、103.3、56.5，在應(yīng)用5uM的As<,2>O<,3>作用24h后，MGC803、BCG823細(xì)胞的活性氧水平明顯增高，而SGC7901細(xì)胞只有少數(shù)細(xì)胞活性氧增高。2uM及5uM的As<,2>O<,3>均引起細(xì)胞內(nèi)的活性氧明顯升高，峰熒光強(qiáng)度分別由對(duì)照的20升高到為80、70，而25uM的As<,2>O<,3>沒有引起明顯的升高。5u

5、M的As<,2>O<,3>作用36h，細(xì)胞內(nèi)活性氧3h開始增高，12h達(dá)到高峰值。2、5、25uM As203作用12及24h后線粒體跨膜電位出現(xiàn)降低，24h的線粒體跨膜電位降低的細(xì)胞數(shù)分別為8.2％、16.1％、23％，能夠呈時(shí)間及濃度依賴性降低線粒體跨膜電位。 2.氮乙酰半胱氨酸(NAC)能夠明顯抑制As<,2>O<,3>對(duì)MGC803細(xì)胞的殺傷作用，聯(lián)合應(yīng)用As<,2>O<,3>48h的IC<,50>濃度大于25uM，單獨(dú)

6、應(yīng)用時(shí)的IC<,50>約為5uM。10mM的NAC與5uM As<,2>O<,3>同時(shí)應(yīng)用12h，NAC明顯降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，對(duì)照組為12.4，單獨(dú)應(yīng)用As<,2>O<,3>組為30.5，而聯(lián)合應(yīng)用組為7.2。48h流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，單獨(dú)應(yīng)用As<,2>O<,3>組亞G<,0>/G<,1>期細(xì)胞為29.32％，G<,2>/M期細(xì)胞為38.19％，出現(xiàn)了亞二倍體峰及G<,2>/M期阻滯，聯(lián)合應(yīng)用組未見亞二倍體峰及G<,2>/M

7、期阻滯，細(xì)胞周期接近正常對(duì)照。 3.5μM As<,2>O<,3>作用24h細(xì)胞形態(tài)學(xué)可見細(xì)胞核濃聚，染色質(zhì)非正常分裂及凋亡小體，有明顯的M期阻滯。25、50μMAs<,2>O<,3>作用24h細(xì)胞可見明顯的核固縮，胞漿空泡變性，未見G<,2>/M期阻滯。5μMAs<,2>O<,3>作用24h后細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞山對(duì)照的1.2％增加到32.8％。壞死細(xì)胞增加到12％。而25μM的As<,2>O<,3>作用24h后壞死細(xì)胞由5.9％

8、增加到72.2％。而凋亡細(xì)胞由對(duì)照的1.2％增加到8.1％，結(jié)果顯示25μM的As<,2>O<,3>作用后主要以細(xì)胞壞死為主。2、5、25、50uMAs<,2>O<,3>作用24h，各濃度As<,2>O<,3>均能引起線粒體Cyto-C向細(xì)胞漿中釋放，線粒體內(nèi)Cyto-C明顯減少。 4.5uM的As<,2>O<,3>作用MGC803細(xì)胞24h，早期凋亡細(xì)胞數(shù)由1.44增至20.37，壞死細(xì)胞由5.7％增加到14.36％，而10u

9、M的BSO與5uM的As<,2>O<,3>聯(lián)合應(yīng)用組，凋亡細(xì)胞由單用As<,2>O<,3>的20.37％降至7.44％，壞死細(xì)胞由14.36％增加到46.11％。結(jié)果提示BSO通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死而不是凋亡來增加As<,2>O<,3>對(duì)MGC803細(xì)胞的殺傷作用。5uM的As<,2>O<,3>作用24h可激活Procaspase-3后出現(xiàn)17及12KD的活性亞基，10uM的BSO與5uM的As<,2>O<,3>聯(lián)合作用后，Procasp

10、ase-3只出現(xiàn)17KD的活性亞基，且表達(dá)水平為單用As<,2>O<,3>的50％。10mM NAC與BSO同時(shí)與5uM的As<,2>O<,3>共同作用24h，Caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組沒有區(qū)別。 5.5μM As<,2>O<,3>作用MGC803細(xì)胞12-48h均誘導(dǎo)Bcl-2蛋白出現(xiàn)磷酸化，12h可出現(xiàn)， 36h Bcl-2蛋白磷酸化達(dá)到峰值，48h減弱，25μM的As<,2>O<,3>作用24h未見Bcl-2蛋白出現(xiàn)

11、磷酸化，Bcl-2蛋白無明顯變化。5μMAs<,2>O<,3>作用MGC803細(xì)胞48h，從24h起可見Caspase-3剪切活化形式17、12 KD的小片段，一直持續(xù)到48h，Procaspase-3無明顯變化。25μMAs<,2>O<,3>作用MGC803細(xì)胞48h，從24h起下調(diào)Procaspase-3，48h接近消失，但未見到活化后形成的小片段。 6.5μM As<,2>O<,3>作用MGC803細(xì)胞6-36h，結(jié)果顯示

12、活性氧在貼壁與非貼壁細(xì)胞中無明顯差別。6h后未貼壁細(xì)胞均出現(xiàn)線粒體跨膜電位(△ψm)降低，24h最明顯，約55％的細(xì)胞線粒體跨膜電位(△ψm)明顯降低。而貼壁細(xì)胞中未見細(xì)胞線粒體跨膜電位(△ψm)的下降。5μMAs<,2>O<,3>作用24h后分離貼壁與q非貼壁細(xì)胞，檢測(cè)Bcl-2、Survivin及Caspase-3蛋白表達(dá)，24h非貼壁細(xì)胞Bcl-2蛋白出現(xiàn)磷酸化，Survivin表達(dá)明顯增高，Caspase-3蛋白被活化，該部分細(xì)

13、胞為凋亡及G<,2>/M期細(xì)胞，兩部分細(xì)胞比例接近，而貼壁細(xì)胞為G<,0>/G<,1>、S及G<,2>期細(xì)胞，Bcl一2蛋白磷酸化水平低于As<,2>O<,3>作用24h的水平，Survivin表達(dá)接近對(duì)照細(xì)胞，Caspase-3蛋白未見明顯活化。貼壁與非貼壁細(xì)胞去除藥物后繼續(xù)培養(yǎng)12、24h，貼壁細(xì)胞Bcl-2、Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)未見明顯變化，非貼壁細(xì)胞Bcl-2蛋白磷酸化減弱，Survivin表達(dá)在繼續(xù)培養(yǎng)

14、12h時(shí)略降低，24h后明顯降低，降至24h分離時(shí)的30％。 7.500nM Okadaic acid及100nM Staurosporine與G<,2>/M期細(xì)胞作用4h，Okadaicacid能夠保持Bcl-2蛋白磷酸化，Staurosporine能夠使Bcl-2蛋白脫磷酸化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Okadaic acid作用2h、4h時(shí)亞二倍體細(xì)胞分別為19.51％、40.8％，Staurosporine作用2h、4h時(shí)亞二倍

15、體細(xì)胞分別為10.61％、11.2％，4h對(duì)照細(xì)胞的亞二倍體細(xì)胞數(shù)為15.27％。 8．5μM的As<,2>O<,3>從12h起明顯上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)，36h達(dá)到峰值，上調(diào)到對(duì)照的2.5倍，48h下降，蛋白表達(dá)水平為對(duì)照的1.4倍。25 uM的As<,2>O<,3>作用72h下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)。Ly294002與As<,2>O<,3>共同作用3-24h，各時(shí)間點(diǎn)均能抑制As<,2>O<,3>對(duì)Survivin表達(dá)的上

16、調(diào)。不同濃度的Ly294002作用12h，呈濃度依賴性抑制As<,2>O<,3>對(duì)Smivin表達(dá)的上調(diào)，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)在的Survivin表達(dá)沒有影響。且能在24h時(shí)增強(qiáng)Bcl-2蛋白磷酸化。25uM Ly294002在24、48h均能增強(qiáng)5uM As<,2>O<,3>誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞凋亡及G<,2>/M阻滯，As<,2>O<,3>單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用Ly294002 24h的亞二倍體細(xì)胞數(shù)為8.2％、14.8％，G<,2>/M期細(xì)胞分別為

17、32.38％、56.4％，48h亞二倍體細(xì)胞數(shù)為15.9％、26.7％，G<,2>/M期細(xì)胞分別為26.72％、42.5％。 研究結(jié)論： As<,2>O<,3>對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷需要活性氧的參與，腫瘤細(xì)胞對(duì)As<,2>O<,3>的敏感性與As<,2>O<,3>作用后活性氧的升高相關(guān)。線粒體途徑是As<,2>O<,3>誘導(dǎo)凋亡與壞死的共同通路，BSO增強(qiáng)低濃度As<,2>O<,3>對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷是通過改As<,2>O<,3