地塞米松對(duì)人眼小梁細(xì)胞通透阻力的影響.pdf

1、目的:目前開(kāi)角型青光眼的確切病因雖然不明，但病理部位已鎖定小梁網(wǎng)。小梁網(wǎng)呈不規(guī)則網(wǎng)狀，由膠原纖維形成的小梁束與其上單層覆蓋的小梁細(xì)胞組成，是房水排出的主要阻力部位。作為房水流出道的內(nèi)皮，小梁細(xì)胞功能活性的改變勢(shì)必影響房水引流的效率，其蛋白的表達(dá)及基因調(diào)控可能是開(kāi)角型青光眼發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。 本研究體外培養(yǎng)人眼小梁細(xì)胞，將地塞米松作為激素性處理因素，利用上皮細(xì)胞電阻測(cè)量?jī)x(EVOM)測(cè)量濾膜上培養(yǎng)的單層小梁細(xì)

2、胞的電阻，同時(shí)應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞水通道蛋白-1(AQP-1)和一種緊密連接蛋白Claudin-1的表達(dá)。將二者結(jié)合起來(lái)以評(píng)價(jià)POAG患者與正常人小梁細(xì)胞的差別、地塞米松對(duì)小梁細(xì)胞通透阻力的影響及兩種蛋白在其中所起的作用。旨在從新的角度解釋房水循環(huán)機(jī)制，為開(kāi)角型青光眼的發(fā)病機(jī)理提供新的思路，為探討其治療措施提供新的方向。 方法:1.人眼小梁細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常人及POAG患者小梁細(xì)

3、胞，傳代培養(yǎng)永生化小梁細(xì)胞株(加拿大VincentRaymond教授惠贈(zèng))，顯微鏡觀(guān)察、免疫組化等方法鑒定小梁細(xì)胞。 2.激素處理小梁細(xì)胞：將細(xì)胞分為對(duì)照組和處理組，處理組細(xì)胞培養(yǎng)液添加10-7mol/L地塞米松進(jìn)行培養(yǎng)，觀(guān)察細(xì)胞變化情況。 3.小梁細(xì)胞通透阻力的檢測(cè)：將各組小梁細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)池(Transwellinserts)的濾膜上，在細(xì)胞單層融合后的不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用EVOM測(cè)量單層小梁細(xì)胞的電阻(TEER，tr

4、ansepithelialelectricalresistance)，以評(píng)價(jià)細(xì)胞通透阻力的大小。 4.小梁細(xì)胞AQP-1、Claudin-1表達(dá)的檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR、Westernblot方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)小梁細(xì)胞AQP-1、Claudin-1的表達(dá)。 結(jié)果:1.成功體外培養(yǎng)正常人眼、POAG患者及永生化小梁細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)：POAG患者與正常人，地塞米松處理組與對(duì)照組，濾膜上與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶/板上生長(zhǎng)的

5、小梁細(xì)胞形態(tài)、分布上未見(jiàn)明顯差別。 2.TEER測(cè)量結(jié)果顯示正常人眼、POAG患者及永生化小梁細(xì)胞單層融合后兩周內(nèi)的平均電阻值基本穩(wěn)定，說(shuō)明該測(cè)量體系較為客觀(guān)穩(wěn)定。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析方法對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，在不同時(shí)間點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)地塞米松處理組可使TEER水平提高。 3.RT-PCR結(jié)果顯示各組小梁細(xì)胞在mRNA水平均有AQP-1、Claudin-1的表達(dá)。 4.Westernblot結(jié)果顯示各組小梁細(xì)胞在

6、蛋白水平均有AQP-1、Claudin-1表達(dá)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)各組細(xì)胞兩種蛋白的表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，但相同時(shí)間點(diǎn)地塞米松處理組兩種蛋白的表達(dá)量明顯較對(duì)照組高。 結(jié)論:1.濾膜培養(yǎng)體系及應(yīng)用EVOM對(duì)細(xì)胞通透阻力的測(cè)量體系較為客觀(guān)穩(wěn)定，可作為今后對(duì)小梁細(xì)胞特性研究的一個(gè)新的較好模型。 2.地塞米松可以增加小梁細(xì)胞的通透阻力，上調(diào)人眼小梁細(xì)胞AQP-1、Claudin-1的表達(dá)。小梁細(xì)胞通透阻力增加與兩種蛋白表達(dá)增高之間可能存