地塞米松對人眼小梁細胞通透阻力的影響.pdf

1、目的:目前開角型青光眼的確切病因雖然不明，但病理部位已鎖定小梁網(wǎng)。小梁網(wǎng)呈不規(guī)則網(wǎng)狀，由膠原纖維形成的小梁束與其上單層覆蓋的小梁細胞組成，是房水排出的主要阻力部位。作為房水流出道的內(nèi)皮，小梁細胞功能活性的改變勢必影響房水引流的效率，其蛋白的表達及基因調(diào)控可能是開角型青光眼發(fā)病的分子基礎(chǔ)，也是當前研究的熱點之一。 本研究體外培養(yǎng)人眼小梁細胞，將地塞米松作為激素性處理因素，利用上皮細胞電阻測量儀(EVOM)測量濾膜上培養(yǎng)的單層小梁細

2、胞的電阻，同時應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測體外培養(yǎng)的人眼小梁細胞水通道蛋白-1(AQP-1)和一種緊密連接蛋白Claudin-1的表達。將二者結(jié)合起來以評價POAG患者與正常人小梁細胞的差別、地塞米松對小梁細胞通透阻力的影響及兩種蛋白在其中所起的作用。旨在從新的角度解釋房水循環(huán)機制，為開角型青光眼的發(fā)病機理提供新的思路，為探討其治療措施提供新的方向。 方法:1.人眼小梁細胞的體外培養(yǎng)和鑒定：用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常人及POAG患者小梁細

3、胞，傳代培養(yǎng)永生化小梁細胞株(加拿大VincentRaymond教授惠贈)，顯微鏡觀察、免疫組化等方法鑒定小梁細胞。 2.激素處理小梁細胞：將細胞分為對照組和處理組，處理組細胞培養(yǎng)液添加10-7mol/L地塞米松進行培養(yǎng)，觀察細胞變化情況。 3.小梁細胞通透阻力的檢測：將各組小梁細胞接種于細胞培養(yǎng)池(Transwellinserts)的濾膜上，在細胞單層融合后的不同時間點應(yīng)用EVOM測量單層小梁細胞的電阻(TEER，tr

4、ansepithelialelectricalresistance)，以評價細胞通透阻力的大小。 4.小梁細胞AQP-1、Claudin-1表達的檢測：應(yīng)用RT-PCR、Westernblot方法分別從mRNA水平和蛋白水平檢測小梁細胞AQP-1、Claudin-1的表達。 結(jié)果:1.成功體外培養(yǎng)正常人眼、POAG患者及永生化小梁細胞，鏡下可見：POAG患者與正常人，地塞米松處理組與對照組，濾膜上與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶/板上生長的

5、小梁細胞形態(tài)、分布上未見明顯差別。 2.TEER測量結(jié)果顯示正常人眼、POAG患者及永生化小梁細胞單層融合后兩周內(nèi)的平均電阻值基本穩(wěn)定，說明該測量體系較為客觀穩(wěn)定。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析方法對測量數(shù)據(jù)進行整體分析，在不同時間點均發(fā)現(xiàn)地塞米松處理組可使TEER水平提高。 3.RT-PCR結(jié)果顯示各組小梁細胞在mRNA水平均有AQP-1、Claudin-1的表達。 4.Westernblot結(jié)果顯示各組小梁細胞在

6、蛋白水平均有AQP-1、Claudin-1表達。隨著時間的延長各組細胞兩種蛋白的表達均呈上升趨勢，但相同時間點地塞米松處理組兩種蛋白的表達量明顯較對照組高。 結(jié)論:1.濾膜培養(yǎng)體系及應(yīng)用EVOM對細胞通透阻力的測量體系較為客觀穩(wěn)定，可作為今后對小梁細胞特性研究的一個新的較好模型。 2.地塞米松可以增加小梁細胞的通透阻力，上調(diào)人眼小梁細胞AQP-1、Claudin-1的表達。小梁細胞通透阻力增加與兩種蛋白表達增高之間可能存