出血性卒中致腦組織纖維化機制實驗與臨床研究.pdf

1、研究背景、目的及意義 轉化生長因子-β<,1>(Transforming growth factor beta 1，FGF-β<,1>)是近十年來發(fā)現的參與機體許多生理病理過程、啟動和終止組織損傷修復的一種主要細胞因子。人體組織器官纖維化的病理基礎是膠原的合成和沉積，TGF-β<,1>通過刺激膠原基因過度表達及其自分泌調控等多種機制在纖維化病變過程中發(fā)揮關鍵作用。 大量周圍組織損傷研究表明，正常低水平表達的TGF-β<,

2、1>出現過度表達，可導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度產生與沉積而成為許多慢性疾病如腎小球硬化、肝纖維化、肺纖維化、硬皮病等疾病的致病因子。近年來TGF-β<,1>過度表達在中樞神經系統(tǒng)(central：neural system，CNS)損傷后的炎性反應、組織纖維增生及膠質瘢痕形成中的重要作用也逐漸受到關注，尤其是蛛網膜下腔出血后并發(fā)交通性腦積水者。 交通性腦積水發(fā)生機制依然不明，除了先天性

3、與原因不明外，大多并發(fā)于蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorThage，SAH)與CNS感染。出血及炎性變使腦膜廣泛纖維化粘連致腦脊液回吸收受阻、蛛網膜粒變性致腦脊液回靜脈通路受阻是較為認可的病理機制，但腦膜纖維化發(fā)生機制及腦脊液循環(huán)與重吸收途徑至今不甚明了。Maillot等提出了腦脊液引流的上行途徑(顱蛛網膜下腔途徑)、淋巴途徑和靜脈途徑，后兩條途徑雖無確切的形態(tài)學證據，但是注入到椎管內的藥物很快以高濃度出現在靜脈系統(tǒng)

4、的事實，提示從腦脊液到靜脈系統(tǒng)之間有直捷通道存在。腦脊液無論經何種途徑吸收，蛛網膜下腔腦膜組織都是腦脊液與靜脈系統(tǒng)間建立循環(huán)與重吸收的基礎結構組織。目前，對其生理及病理學改變仍存有許多未知，尤其是在遭受出血及炎癥侵襲時腦膜纖維化病理改變發(fā)生機制不明。隨著周圍組織纖維化機制的不斷深入研究，以TGF-β<,1>為主要細胞因子參與的組織損傷與修復的一系列信號轉導機制被不斷認識，TGF-β<,1>在中樞神經系統(tǒng)疾病中的作用也開始被人們所關注。已

5、發(fā)現在腦出血、SAH、腦缺血與缺氧等疾病中，TGF-β<,1>有明顯異常表達，有報道重組TGF-β<,1>鞘內注射及轉基因大鼠均發(fā)生腦脊液引流障礙，表明該因子在腦積水形成中的重要作用。 膠質疤痕是CNS受損或病理過程的普遍性結果，其致密屏障可阻礙神經軸突再生及功能重建。隨著神經干細胞移植的深入研究，許多問題亟待解決，神經細胞的再生阻礙也漸為人所關注。星形膠質細胞(astrocyte，As)是組成膠質疤痕的主要膠質細胞成分，在遭受

6、損傷后，可產生各種生長因子及細胞調節(jié)因子，包括TGF-β<,1>。因TGF-β<,1>的生理功能多樣，直接抑制會導致許多負面效應，而結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是介導TGF-β<,1>促纖維化作用的一個重要的下游因子，生物學效應單一，直接抑制它的表達也許可以避免在TGF-β<,1>上游阻斷帶來的副作用。因此，CTGF可能作為神經干細胞移植治療CNS疾病中抑制膠質增生負性作用

7、的靶點。 凝血酶是血腫成分中最特殊的物質，隨著不同凝血酶受體相繼發(fā)現，凝血酶被當作一種細胞外信號分子，具有廣泛的細胞生物學效應，凝血酶對神經細胞的保護與毒性雙重作用與出血量密切相關而在出血性腦損傷中倍受關注。用小劑量凝血酶(1～2u/ml)預處理可明顯保護神經元和膠質細胞免受低血糖、缺血缺氧等損傷引起的細胞死亡；較高濃度的凝血酶可使神經元的軸突和樹突退變，軸突回縮、細胞聚集，膠質細胞星形化受阻，并破壞細胞間的相互作用以及和毛細血

8、管間的聯(lián)系；而微克分子濃度的凝血酶便可導致體外培養(yǎng)的神經元和膠質細胞程序性死亡；加入水蛭素(hirudin)、蛋白酶連素-1等凝血酶特異性抑制物時，這些效應會逆轉。在周圍組織研究發(fā)現，凝血酶和TGF-β<,1>共同介導對SMalphA基因的表達增加，造成人成纖維母細胞過度分化，刺激腎近曲小管上皮細胞分泌和產生金屬蛋白酶，促進Ⅳ型膠原合成，而在中樞組織方面的相關性研究未見報道。探討凝血酶在出血性腦血管病中與TGF-β<,1>的相關性，研究

9、在中樞組織損傷修復中的作用，并在此層面進行有效抑制，不僅為防治SAH后交通性腦積水找到有效的作用靶點，也可能成為治療腦細胞水腫、炎性改變、膠質瘢痕形成共同的作用靶點。周圍組織有研究表明細胞因子TGF-β<,1>在皮膚增生性瘢痕形成中起到相當重要的作用，它可增加膠原基因的轉錄及膠原合成，而糖皮質激素可通過多種途徑抑制膠原的轉錄、合成。但有關糖皮質激素作用的確切分子生物學機制及與TGF-β<,1>之間的相互關系仍不明確。Ghahary等以膠

10、原基因的調控序列為研究對象，在轉錄水平探討地塞米松與TGF-β<,1>之間的相互作用及對人al(Ⅰ)前膠原基因啟動活性的影響。實驗顯示：在正常成纖維細胞中，TGF--β<,1>能明顯上調Ⅰ膠原基因的啟動活性，而地塞米松則能顯著抑制Ⅰ膠原基因的啟動活性，提示它們能在轉錄水平調控Ⅰ膠原基因的轉錄，這與它們在膠原基因mRNA水平的作用相一致。同時，地塞米松能拮抗TGF-β<,1>對人a1(Ⅰ)前膠原基因啟動活性的上調作用，在轉錄水平進一步證實

11、了Meisler的研究。由此可見，在轉錄水平地塞米松抗纖維化作用不僅表現為能直接抑制膠原基因的啟動轉錄，而且能拮抗TGF-β<,1>的致纖維化作用。 廣泛纖維化、膠質增生是CNS損傷的標志，研究TGF-β<,1>在神經系統(tǒng)疾病中的異常表達機制，探討CNS組織損傷后纖維化修復機制。利用RT-PCR、Western-blotting、RNA干擾、轉染等分子生物學技術，研究TGF-β<,1>、凝血酶等對大鼠星形細胞形態(tài)學變化、軟腦膜纖

12、維化、星形細胞的CTGF表達和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達等；提出凝血酶可能作為啟動因子參與TGF-β<,1>的過度表達，可能出TGF-β<,1>誘導，CTGF介導星形細胞反應性膠質化理論：揭示組織纖維化機制，償試解決神經損傷修復過程中的再生阻礙及組織纖維化粘連中的關鍵問題，為防治中樞組織粘連性疾病如交通性腦積水(communicating hydrocephalus)

13、等尋找新思路，為促進神經干細胞移植軸突的再生修復、抑制膠質膠質瘢痕的負性作用、最大限度地保存和恢復神經功能尋找有效的干預位點。 目的 1．研究凝血酶與TGF-β<,1>過度表達的相關性，探討SAH后交通性腦積水的發(fā)生機制。 2．研究TGF-β<,1>對培養(yǎng)的新生SD大鼠星形細胞膠質化及CTGF表達的影響。采用體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質細胞，以TGF-β<,1>為刺激因子，建立腦損傷的細胞模型，觀察星形膠質細胞形態(tài)學變

14、化，以及該細胞骨架蛋白膠質纖維酸性蛋白(GFAP)與CTGF基因翻譯水平和蛋白質合成水平的變化，探討CNS損傷后反應性膠質化的發(fā)生機制。 3．研究SAH后腦室擴大的影像學改變，探討地塞米松蛛網膜下腔炎性抑制對交通性腦積水發(fā)生的預防作用。 結論 1.改良了研究所需的實驗細胞模型，采用改良的星形細胞培養(yǎng)方法可獲得高純度細胞，為在細胞水平上研究纖維化成為可能。以TGF--β<,1>體外培養(yǎng)的SD大鼠星形質細胞可造成星形

15、細胞的膠質化，較好的模擬了出血后組織纖維化的細胞模型。 2.證實了蛛網膜下腔內注入一定量凝血酶，可引起腦脊液中的TGF-β<,1>持續(xù)高水平表達，并導致形態(tài)學上軟腦模的明顯增厚。推測凝血酶是引起蛛網膜下腔出血后交通性腦積水的重要介導因素。 3.發(fā)現了TGF-β<,1>可介導星形膠質細胞CTGF mRNA和蛋白的高表達，其表達水平與TGF-β<,1>嘗試有明顯的量效關系。進…步證實CTGF是TGF-β<,1>促CNS纖維化