白甲烏鱧種質(zhì)分析、白化特征機(jī)理及其熱休克蛋白基因的研究.pdf

1、本研究以珍稀的白甲烏鱧作為研究材料，利用形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法對白甲烏鱧和烏鱧進(jìn)行了比較研究，綜合探討了其分類歸屬、皮膚白化特征機(jī)理及其引種養(yǎng)殖過程中的抗應(yīng)激能力等問題。
　　1.基于形態(tài)學(xué)方法的部分鱧屬魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
　　本章運(yùn)用傳統(tǒng)形態(tài)度量法與框架法對5種鱧89個(gè)個(gè)體的11個(gè)可數(shù)和29個(gè)可量性狀進(jìn)行了測量。主成分分析顯示所有5個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到78.928％。主成分分析散點(diǎn)圖顯示白甲烏鱧和烏鱧重

2、疊最大。聚類分析顯示各種間可完全區(qū)分，其中白甲烏鱧和烏鱧親緣關(guān)系最近。通過X射線攝影發(fā)現(xiàn)白甲烏鱧和烏鱧形態(tài)結(jié)果較為相似。由此可知，白甲烏鱧和烏鱧較為相近，無明顯區(qū)別，雜交鱧也偏向于父本烏鱧。
　　2.基于毛細(xì)管電泳的AFLP標(biāo)記技術(shù)探討部分鱧屬魚類親緣關(guān)系
　　本章采用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)研究了8種鱧屬魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。共篩選出10對選擇性擴(kuò)增引物組合，擴(kuò)增總條帶范圍為114-206，一致性條帶為0-12，多態(tài)性條帶為

3、114-196。聚類結(jié)果顯示，依相似系數(shù)0.58的水平，烏鱧、白甲烏鱧、雜交鱧和斑鱧聚為一支，且烏鱧和白甲烏鱧的親緣關(guān)系最近，月鱧和帶鱧聚為一支，而線鱧和小盾鱧分別單獨(dú)聚為一支。該技術(shù)能有效區(qū)分鱧屬魚類的親緣關(guān)系，為種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供一定的分子佐證材料。
　　3.基于白甲烏鱧線粒體DNA全序列及其12s RNA、Cytb和CO1基因與D-Loop控制區(qū)序列的鱧科魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
　　本章首先測定了白甲烏鱧線粒體DNA全基

4、因組序列，全長16558bp，與烏鱧一致。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建鱧科魚類的遺傳距離，其中白甲烏鱧和烏鱧之間的遺傳距離為0.002。采用NJ、ME和ML法分別構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，其中白甲烏鱧、烏鱧和烏斑雜交鱧單獨(dú)聚為一支。同時(shí)比較分析了其12s rRNA、Cytb和CO1基因及其D-Loop控制區(qū)序列，白甲烏鱧和烏鱧單倍型序列之間的最大遺傳距離均小于0.010，分別為0.006、0.002、0.002和0.004；分子系統(tǒng)樹顯示它們所有單

5、倍型均單獨(dú)聚為一支，且交叉排列，進(jìn)一步得出白甲烏鱧應(yīng)作為烏鱧白化變異種的結(jié)論。
　　4.白甲烏鱧與烏鱧基本營養(yǎng)成分、皮膚黑色素含量及其組織學(xué)分析
　　選取同一養(yǎng)殖水域的白甲烏鱧和烏鱧。分析肌肉基本營養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)白甲烏鱧較烏鱧有更高的食用營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)測定其皮膚黑色素含量顯著低于烏鱧。光學(xué)顯微鏡觀察白甲烏鱧與烏鱧鱗片和皮膚黑色素細(xì)胞在分布、密度、形態(tài)、大小和生長狀態(tài)等方面存在明顯差異。H&E和黑色素染色技術(shù)比較觀察皮膚顯微結(jié)構(gòu)發(fā)

6、現(xiàn)白甲烏鱧皮膚色素層趨于退化，且無明顯黑色素細(xì)胞分布。利用透射電子顯微鏡對比分析皮膚超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)白甲烏鱧皮膚黑色素細(xì)胞的黑色素體密度較小，排列混亂，呈現(xiàn)多種形狀，真皮層的各層細(xì)胞排列不規(guī)則，無層次性?？梢?，黑色素細(xì)胞和黑色素沉積的缺乏、黑色素體密度較小等是導(dǎo)致白甲烏鱧皮膚白化現(xiàn)象的組織學(xué)原因。
　　5.白甲烏鱧酪氨酸酶（TYR）基因的克隆，表達(dá)及其分子特征
　　克隆了白甲烏鱧和烏鱧TYR基因cDNA全長，兩者序列一致。同源比

7、對發(fā)現(xiàn)，與硬骨魚類相似性較高，而與細(xì)菌類相似度較低。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示TYR基因在白甲烏鱧和烏鱧9大組織（皮膚、眼睛、肌肉、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、鰓和腸道）中均有表達(dá)。其中，白甲烏鱧眼睛組織表達(dá)量最高，而烏鱧皮膚組織的表達(dá)量最高。對比相同組織發(fā)現(xiàn)，烏鱧皮膚組織TYR基因表達(dá)量極顯著高于白甲烏鱧（18.66倍）。細(xì)胞免疫熒光觀察亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)膜等部位，與預(yù)測結(jié)果一致?？梢?，TYR基因可能作為參與烏鱧皮膚

8、黑色素細(xì)胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)的重要因子，其低表達(dá)是皮膚出現(xiàn)白化特征的關(guān)鍵因素之一。
　　6.白甲烏鱧小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）基因的克隆，表達(dá)及其分子特征分析
　　克隆了白甲烏鱧和烏鱧MITF基因cDNA全長，兩者序列一致。同源比對發(fā)現(xiàn)，與硬骨魚類相似性較高，而與昆蟲類相似性較低。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示MITF基因在白甲烏鱧心臟組織表達(dá)量最高，而在烏鱧肌肉組織表達(dá)量最高。對比相同組織發(fā)現(xiàn)，烏鱧皮膚 基因表達(dá)量

9、極顯著高于白甲烏鱧（8.77倍）。細(xì)胞免疫熒光觀察亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核，與預(yù)測結(jié)果一致?？梢?，MITF基因可能作為參與白甲烏鱧皮膚體色調(diào)控，其低表達(dá)可能與皮膚出現(xiàn)白化特征密切相關(guān)。
　　7.白甲烏鱧SOX10基因的克隆，表達(dá)及其分子特征分析
　　克隆了白甲烏鱧和烏鱧SOX10基因cDNA全長，兩者序列一致。同源比對發(fā)現(xiàn)，與硬骨魚類的相似性較高，而與其它脊椎動(dòng)物相似性較低。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示SOX10基因在白甲烏

10、鱧眼睛組織的表達(dá)量最高，而在烏鱧皮膚組織中表達(dá)量最高。對比相同組織發(fā)現(xiàn)，烏鱧皮膚SOX10基因表達(dá)量極顯著高于白甲烏鱧（14.44倍）。細(xì)胞免疫熒光觀察亞細(xì)胞主要定位于細(xì)胞核，與預(yù)測結(jié)果一致?？梢姡琒OX10基因可能參與白甲烏鱧體色調(diào)節(jié)，其低表達(dá)是皮膚出現(xiàn)白化特征的重要因素之一。
　　8.白甲烏鱧HSP60基因的克隆，表達(dá)及其分子特征分析
　　克隆了白甲烏鱧HSP60基因cDNA和基因組DNA全長，符合HSP60基因家族的特

11、征。同源比對發(fā)現(xiàn)，與硬骨魚類相似性極高，而與細(xì)菌類的相似性較低。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)正常對照組（0h）HSP60基因的表達(dá)存在顯著組織特異性。相比于常溫處理組（26℃），經(jīng)熱處理（37℃）后的白甲烏鱧腦、腎臟、肝臟和脾臟組織HSP60基因的表達(dá)量均極顯著的升高，而低溫處理組（8.5℃）除腦組織表現(xiàn)出極顯著性降低外，其他組織均無顯著差異。注射遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）（菌株NO. DL1476）不同時(shí)間（

12、0-，6-，12-，24-，36-，48-，72h）后的HSP60基因在白甲烏鱧大腦、脾臟和腎臟組織中不同時(shí)間均出現(xiàn)極顯著的升高；在肝臟中一直處于高表達(dá)狀態(tài)。可見，HSP60基因在應(yīng)對外界不良環(huán)境因子、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)、保證正常生命活動(dòng)起到重要調(diào)節(jié)作用。
　　9.白甲烏鱧HSP70基因的克隆，表達(dá)及其分子特征分析
　　克隆了白甲烏鱧HSP70基因cDNA和基因組DNA全長，符合HSP70基因家族的特征。同源比對發(fā)現(xiàn)，與所用物種相

13、似性均很高。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)正常對照組四大組織的表達(dá)存在高度特異性。相比于常溫處理組，熱處理后的四大組織HSP70基因均表現(xiàn)出極顯著的升高，而低溫處理組均無顯著差異。經(jīng)過注射遲緩愛德華氏菌不同時(shí)間后的四大組織均出現(xiàn)極顯著的升高。結(jié)果說明HSP70基因在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)及保護(hù)其致病的過程中發(fā)揮極其重要的作用。
　　10.白甲烏鱧HSP90基因的克隆，表達(dá)及其分子特征分析
　　克隆了白甲烏鱧HSP90基因cDNA和基因

14、組DNA全長，符合HSP90基因家族的特征。同源比對發(fā)現(xiàn)，與硬骨魚綱的魚類相似性很高，而與細(xì)菌類相似性較低。相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)正常對照組四大組織存在特異性表達(dá)。相比于常溫處理組，熱處理后的四大組織HSP90基因均表現(xiàn)極顯著升高，而低溫處理組均無顯著性差異。經(jīng)過遲緩愛德華氏菌注射不同時(shí)間后的四大組織均出現(xiàn)了極顯著的升高，在肝臟組織中一直呈現(xiàn)高表達(dá)?？梢?，HSP90基因能夠有效的應(yīng)對熱應(yīng)激和病原菌感染，對正常生命活動(dòng)起到重要的調(diào)節(jié)作