鯽魚肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶內(nèi)源性抑制劑的研究.pdf

1、魚糜加工過程中發(fā)生的凝膠劣化現(xiàn)象是影響魚糜品質(zhì)的重要因素。與海水魚相比,淡水魚魚糜加工更容易產(chǎn)生凝膠劣化。目前研究表明,魚肌肉中含有的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)降解肌原纖維蛋白是造成魚糜凝膠劣化的主要原因。因此,尋找一種天然有效的MBSP抑制劑來防止魚糜的凝膠劣化,成為目前魚糜加工技術(shù)的另一方向。近年,從白姑魚肌肉中分離出一種內(nèi)源性的肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Myofibril-bound serine protei

2、nase inhibitor,MBSPD,且與豬的GPI具有高度的同源性。關(guān)于淡水魚MBSPI的研究尚未見報(bào)道,本研究以鯽魚為材料,研究其肌肉中MBSP的天然內(nèi)源性抑制劑,并嘗試初步解釋二者之間的作用機(jī)理。
　　 本研究通過緩沖液抽提、酸沉淀、離子交換色譜、親和層析等方法從鯽魚肌肉肌原纖維中純化得到MBSP,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析。純化MBSP的回收率為2.4％,純化倍數(shù)為600倍,MBSP對(duì)胰蛋白酶類底物都有不同程度降解,其中對(duì)B

3、oc-Gln-Arg-Arg-MCA降解最為顯著,對(duì)組織蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA、氨肽酶底物Arg-MCA以及胰凝乳蛋白酶底物Suc-Leu-Leu-Val-Try-MCA與Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA均不分解作用。抑制劑試驗(yàn)結(jié)果顯示,絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)MBSP有強(qiáng)烈抑制,E-64對(duì)MBSP有部分抑制。以上結(jié)果說明MBSP屬于胰蛋白酶類的絲氨酸蛋白酶。通過硫酸銨分級(jí)沉淀、Q-Sepharose離子交換層析

4、、Superdex200凝膠過濾層析得到純化,回收率為8.0％,純化倍數(shù)為468倍。通過凝膠過濾測(cè)定的分子量為120kDa,而在SDS-PAGE中,則檢測(cè)到2個(gè)不同的亞基(55kDa,65kDa),推測(cè)其為異源二聚體結(jié)構(gòu)。通過LC-MS/MS高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行的肽指紋圖譜鑒定結(jié)果顯示,得到的肽段與斑馬魚gpia的同源性為91.7％,與gpib的同源性為97.5％。以果糖-6-磷酸(F-6-D)為底物時(shí),GPI的Km=0.36mmol

5、/L，GPI的最適pH與溫度分別為8.5與50℃,且在pH8.0-9.5與40℃以下較穩(wěn)定。鯽魚GPI能特異抑制鯽魚MBSP活性,而對(duì)其它類型的絲氨酸蛋白酶以及白姑魚的MBSP沒有抑制作用。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明GPI對(duì)MBSP屬于可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制,其Ki為0.075μmol/L。GPI對(duì)MBSP降解肌原纖維蛋白酶的抑制試驗(yàn)顯示,GPI對(duì)肌原纖維的降解有較明顯的抑制作用,其中肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動(dòng)蛋白(Actin)、原肌球蛋白(Tropom