Rho激酶在醛固酮腎臟損傷中的作用.pdf

1、慢性腎臟病(CKD)是危害人類健康的主要疾患之一。探討影響CKD進(jìn)展的因素并尋找延緩或阻斷其進(jìn)展的新策略至關(guān)重要。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮與高血壓、臟器纖維化等病變密切相關(guān)。關(guān)于醛固酮的多方面、多層次研究仍然方興未艾。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明醛固酮作為一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素參與腎臟纖維化的過程，是CKD進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵因子。但是人們對(duì)醛固酮與腎臟纖維化關(guān)系的認(rèn)識(shí)只是初步的，其確切的機(jī)制并未完全明了。 Rho激酶，作為小G蛋

2、白R(shí)ho的一個(gè)效應(yīng)因子，能促進(jìn)細(xì)胞應(yīng)力纖維和黏附斑的形成，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合，從而介導(dǎo)包括平滑肌收縮、細(xì)胞與基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞間粘附、細(xì)胞遷移、增生、分化、有絲分裂等與腎臟損傷相關(guān)的細(xì)胞功能。已在多種腎損傷動(dòng)物模型通過抑制Rho激酶減輕了腎臟損傷而不依賴于血壓變化。近來有研究發(fā)現(xiàn)Dah1鹽敏感高血壓大鼠其腎損傷的嚴(yán)重性與腎組織高Rho激酶mRNA水平及肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化增多有關(guān)，而且特異性鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑eplere

3、none阻滯了MLC磷酸化同時(shí)改善了腎損傷。這表明醛固酮/Rho激酶通路在介導(dǎo)Dah1鹽敏感高血壓大鼠腎損傷中的重要作用，但是目前還沒有直接的證據(jù)證明Rho激酶在醛固酮腎損傷發(fā)生中的作用。 血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是已被證明的致炎癥及纖維化因子。而且有研究表明在醛固酮/氯化鈉誘導(dǎo)的腎損傷模型存在腎內(nèi)AngⅡ高表達(dá)，且AngⅡ是Rho/Rho激酶通路激活的主要因子，但目前尚沒有在醛固酮腎損傷模型Rho激酶和AngⅡ之間關(guān)系方面的研

4、究報(bào)道。 目的： 本研究利用單腎切除/醛固酮/氯化鈉腎損傷模型，給予Rho激酶抑制劑fasudil長(zhǎng)期干預(yù)治療，觀察Rho激酶是否參與醛固酮/氯化鈉誘導(dǎo)的腎臟損傷，以及Rho激酶抑制能否有獨(dú)立于血壓下降之外的腎臟保護(hù)作用；并研究致纖維化信號(hào)通路TGF-β1-Smad-CTGF是否介導(dǎo)了醛固酮腎損傷作用，以及AngⅡ在此損傷模型中的角色及與Rho激酶相互關(guān)系，從而為臨床尋找新的降低蛋白尿和延緩腎功能下降的治療途徑提供理論和

5、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：健康雄性5周齡SD大鼠在實(shí)驗(yàn)初始行右腎切除，手術(shù)后2周給予1％氯化鈉飲水。隨機(jī)將大鼠分三組：1、對(duì)照組(2％酒精皮下泵入，n=9)；2、醛固酮組(醛固酮0.75ug/kg皮下泵入，n=9)；3、醛固酮+fasudil組(醛固酮0.75u/kg；皮下泵入+fasudil 10mg/kg.day。皮下注射，n=8)。其中醛固酮和酒精均采用滲透微泵置于肩胛間皮下泵入，每?jī)芍茉诒桨捅韧茁樽?50mg/kg腹腔注射)下更

6、換滲透微泵。共治療5周。每周測(cè)定體重；分別在治療0周，1周，3周，5周末測(cè)定清醒狀態(tài)下收縮壓，然后把大鼠放入代謝籠收集24小時(shí)尿液；尿蛋白測(cè)定及血漿、尿液肌酐測(cè)定分別采用試劑盒；血漿及腎組織標(biāo)本在5周末處死前收集；腎組織行PAS和Masson染色觀察組織學(xué)改變；放免法測(cè)定腎皮質(zhì)AngⅡ含量；westernblot法觀察腎皮質(zhì)磷酸化MYPTl(代表Rho激酶活性)、磷酸化Smad2/3和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)蛋白表達(dá)； real-ti

7、me PCR法檢測(cè)腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、膠原Ⅰ和膠原Ⅲ mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1、與對(duì)照組比較，醛固酮/鹽長(zhǎng)期灌注使單腎切除大鼠體重明顯減輕(430±10g vs 522±8g，P≤0.05)，腎臟重量及腎重/體重的比率增加(分別為5.74±0.23g vs 2.97±0.14g，P<0.05； 1.32±0.08％vs 0.52±0.03％，JP≤0.05)。醛固酮組

8、和fasudil治療組大鼠體重?zé)o顯著差別。fasudil治療使腎臟重量及腎重/體重的比率明顯減少(分別為4.75±0.34g及0.97±0.07％，與醛固酮組比較差異顯著，P≤0.05)。與對(duì)照組比較，醛固酮/1％氯化鈉應(yīng)用5周還降低了單腎切除大鼠肌酐清除率(0.26±0.01 m1.min.g1 kidney wt vs 0.58±0.04m1.min.gq kidney wt，P≤0.05)，并且使血漿肌酐水平升高(0.73±0.0

9、9mg.d11vs0.59±0.01 mg.dl，P≤0.05)。Fasudil治療明顯改善了肌酐清除率的變化(0.35±0.02 m1.min～g1 kidney wt)，并使血漿肌酐水平下降(0.60±0.02mg.d1-1)，與醛固酮組比較差異顯著(P≤0.05)。 2、三組單腎切除大鼠在治療前收縮壓和尿蛋白排泄無差異。1％氯化鈉進(jìn)飲5周使得收縮壓輕微升高(130±4mmHg，5周VS 117±2mmHg，0周，P≤0.

10、05)，同時(shí)伴有尿蛋白排泄稍微增加(22±3 mg.24h-1，5周VS 5±2 mg.24h-1，0周，P≤0.05)。醛固酮/1％氯化鈉灌注使得大鼠收縮壓隨時(shí)間漸進(jìn)升高，5周末達(dá)到193±3 mmHg，同時(shí)，尿蛋白量顯著增加(362±93 mg.24h-1 VS 22±3mg.24h-1。P≤0.05)。Fasudil治療5周未能使收縮壓降低(191±9mmHg)，卻明顯減少了尿蛋白排出(362±93 mg.24h-1 VS 96±

11、22mg.24h-1，P≤0.05)。 3、與對(duì)照組比較，醛固酮組大鼠和fasudil治療組大鼠5周末腎皮質(zhì)AngII水平顯著增高(分別為154±16pmol.g-1，148±11pmol.g-1 VS 81±8pmol.g-1，P≤0.05)，fasudil治療對(duì)其無影響。 4、對(duì)照組單腎切除大鼠基本上表現(xiàn)為正常的腎小球和腎小管間質(zhì)；醛固酮組大鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的腎小球內(nèi)細(xì)胞增生和硬化，有的腎小球表現(xiàn)為纖維素樣壞死，腎小管明

12、顯擴(kuò)張，有的小管萎縮，蛋白管型增加，嚴(yán)重間質(zhì)纖維化，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球增生指數(shù)和腎間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯增高(分別為3.24±0.50 VS 0.79±0.18，P≤0.05；2.72±0.26 VS 0.43±0.15，P≤0.05)。Fasudil治療使上述改變明顯減輕(分別為1.88±0.52和1.17±0.39)，且差異顯著(P≤0.05)。 5、Western blot條帶分析顯示，與對(duì)照組相比，醛固酮持續(xù)泵入誘使腎皮

13、質(zhì)磷酸化MYPT1、磷酸化Smad2/3和ACE蛋白表達(dá)明顯增加(分別為5.46±0.70 VS1.00±0.23，P≤0.05；4.88±0.24 VS 1.00±0.18，P≤0.05：3.01±0.75 VS 1.00±0.42，P≤0.05)。Fasudil干預(yù)治療明顯減少了前二者的磷酸化表達(dá)(分別為1.63±0.20和1.98±0.15，P≤0.05)，但ACE表達(dá)(2.95±0.65)無變化。 6、與對(duì)照組比較，醛固

14、酮組腎皮質(zhì)TGFβ1、CTGF、膠原Ⅰ和膠原Ⅲ mRNA的表達(dá)明顯增加(分別為2.64±0.10 VS 1.00±0.05，P≤0.05：3.23±0.20 VS1.00±0.18，P≤0.05；3.86±0.20 VS 1.00±0.04，P≤0.05；2.63±0.14 VS 1.00±0.04，P≤0.05)。Fasudil治療使上述靶基因mRNA表達(dá)顯著降低(分別為1.74±0.22、2.34±0.26、2.42±0.41和1.

15、94±0.27)，與醛固酮組比較差異顯著(P≤0.05)。 結(jié)論： 1、在醛固酮/鹽持續(xù)作用下，單腎切除的SD大鼠出現(xiàn)蛋白尿及腎臟纖維化的同時(shí)伴有Rho激酶活性增強(qiáng)，抑制Rho激酶活性明顯減輕了蛋白尿及腎臟纖維化，說明Rho激酶直接參與了醛固酮/鹽持續(xù)灌注SD大鼠的腎臟損傷； 2、單腎切除的SD大鼠，醛固酮/鹽持續(xù)作用誘導(dǎo)腎臟纖維化的同時(shí)，伴有腎皮質(zhì)TGF-β1、CTGF mRNA及Smad2/3蛋白高表達(dá)，Rh

16、o激酶抑制減輕了上述基因及蛋白的表達(dá)，說明在醛固酮/鹽持續(xù)灌注SD大鼠的腎臟纖維化過程中，TGF-β1-Smad2/3-CTGF信號(hào)通路參與并介導(dǎo)了Rho激酶的腎損傷作用； 3、fasudil通過抑制Rho激酶活性，在沒有影響血壓的情況下減輕了醛固酮/鹽誘導(dǎo)的腎臟損傷，說明其有不依賴于降壓作用的腎臟保護(hù)作用； 4、在醛固酮/鹽誘導(dǎo)的腎臟損傷模型中，腎皮質(zhì)AngⅡ水平增高，同時(shí)伴有ACE高表達(dá)，說明高AngⅡ水平可能來源于