腺病毒介導(dǎo)的CD-TK融合基因聯(lián)合GCV和-或5-Fc對人膀胱癌的治療作用.pdf

1、研究背景：膀胱移行細胞癌(transitional-celltumorTCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。其發(fā)生率在人體腫瘤發(fā)生率中男性為第4位，女性為第8位。美國每年新增膀胱癌患者約50.000人。膀胱癌在診斷時有75-80％為未侵犯膀胱肌層的表淺性TCC。表淺性TCC首選采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBt)進行治療。若僅行電切術(shù)，其術(shù)后有50％-70％患者將在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)腫瘤中10％-15％會向膀胱肌層浸潤發(fā)展成為浸潤性TC

2、C。30％浸潤性TCC患者將在2年內(nèi)死亡。 為預(yù)防表淺性TCC電切術(shù)后復(fù)發(fā)，術(shù)后進行膀胱內(nèi)灌注絲裂霉素、卡介苗等藥物是最簡單、有效且常用的一種方法。灌注治療后，表淺性TCC電切術(shù)后復(fù)發(fā)率可以下降20％左右，但復(fù)發(fā)率仍有30％-50％，且不論采取何種預(yù)防治療措施，10-15％向膀胱肌層浸潤發(fā)生率不會改變。因此臨床上渴望有新的治療措施來更有效的治療TCC。 基因治療的出現(xiàn)與發(fā)展，為人們最終戰(zhàn)勝TCC帶來了希望。在腫瘤基因治療

3、諸多策略中，向腫瘤細胞導(dǎo)入“自殺基因(suicidegene)”并激活腫瘤細胞自殺的治療策略倍受重視。 單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)基因(HSV-TK基因)和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(E.colicytocinedeaminase，CD)基因是最常用的兩種自殺基因。若能將HSV-TK基因或CD基因?qū)肽[瘤細胞中并使之有效地表達，就可以用丙氧鳥苷(ganc

4、iclovirGCV)、無環(huán)鳥苷(acyclovirACV)或5-氟胞嘧啶(5-flurocytosine5-Fc)直接殺傷腫瘤。用該類基因治療腫瘤還存在“旁觀者效應(yīng)(bystandereffect)”，即TK/GCV或CD/5-FC不僅能殺死轉(zhuǎn)導(dǎo)了該基因的腫瘤細胞，而且能殺死周圍部分未轉(zhuǎn)導(dǎo)該基因的腫瘤細胞。 目前應(yīng)用HSV-TK或CD基因治療膀胱癌的研究正在進行當中。1997年2月美國SuttonMA等最先報道了用腺病毒載體介

5、導(dǎo)TK基因轉(zhuǎn)染并聯(lián)合GCV治療鼠膀胱癌取得成功，預(yù)示著良好的應(yīng)用前景。此后FreundCT、MoonDG、AkasakaS等先后發(fā)表了類似的研究論文。而ZhangZ等利用CD/5-FC系統(tǒng)研究膀胱癌的治療也取得了較好的效果。TrinhQT、RogersRP、RogulskiKR等的研究顯示不同的腫瘤細胞對不同自殺基因有不同敏感性，在應(yīng)用自殺基因治療各種腫瘤時可能存在腫瘤細胞特異性。為充分發(fā)揮自殺基因作用，部分學(xué)者已利用CD-TK雙自殺基

6、因融合基因治療腫瘤，其中在腦膠質(zhì)瘤、肝癌、卵巢癌等腫瘤中已得到部分應(yīng)用并取得較好效果，在泌尿系統(tǒng)腫瘤特別是前列腺癌的治療中也已進行了較多研究，部分已進行到臨床一期實驗。但目前尚未見到有關(guān)CD-TK融合基因在膀胱癌治療方面的報道。CD-TK融合基因的產(chǎn)物同時具有2種酶的活性，利用兩類自殺基因療法互補作用，可以大大提高其應(yīng)用價值，而不需考慮自殺基因法療的腫瘤細胞類型依賴性。據(jù)此我科建立了攜帶CD-TK融合基因的復(fù)制缺陷腺病毒載體，并設(shè)計本實

7、驗，期望能通過體內(nèi)外實驗明確融合基因是否較單基因存在優(yōu)勢，是否存在協(xié)同效應(yīng)，并為發(fā)現(xiàn)一條治療膀胱癌的新路做一些有意義的探索。 目的：研究復(fù)制缺陷腺病毒載體介導(dǎo)的CD-TK融合基因在體外能否順利轉(zhuǎn)染人膀胱癌細胞、轉(zhuǎn)染后聯(lián)合前體藥物在體外對人膀胱癌細胞是否存在殺傷作用及旁觀者效應(yīng)，及其殺傷機制是否與凋亡相關(guān)，并比較融合基因與單基因?qū)δ[瘤細胞生長抑制方面有無差異，是否存在協(xié)同效應(yīng)。通過體內(nèi)實驗研究裸鼠腫瘤形成后，通過瘤體內(nèi)注射腺病毒法

8、能否使腫瘤細胞順利轉(zhuǎn)染目的基因，轉(zhuǎn)染后目的基因能否順利表達，聯(lián)合前體藥物后在體內(nèi)能否抑制裸鼠腫瘤生長，能否延長荷瘤裸鼠生存期，并觀察治療后腫瘤病理變化。為研究融合基因療法能否有效治療膀胱腫瘤提供實驗依據(jù)。 方法 體外實驗：利用含有CD-TK融合基因及綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteinGFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染人膀胱癌細胞株T-24細胞，以GFP表達與否作為轉(zhuǎn)染是否成功間接標志，PCR及瓊脂

9、糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)染后細胞CD及TK基因表達情況。應(yīng)用GCV和/或5-Fc作用于轉(zhuǎn)染病毒前后T-24細胞，并以四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyltetrazoliumMTT)法檢測治療后不同時間T-24細胞的存活率(實驗組OD/對照組OD)％。按比例混合轉(zhuǎn)染后T-24細胞及未轉(zhuǎn)染T-24細胞，同法給予前體藥物，MTT法檢測旁觀者效應(yīng)。并利用HE染色及Hoechst-PI雙染試劑盒檢測其細胞殺傷機理是否與凋亡相關(guān)。 體內(nèi)

10、實驗：T-24細胞懸液注射入裸鼠頸部皮下，待成瘤后取腫瘤細胞進行原代培養(yǎng)。細胞穩(wěn)定傳代后建立裸鼠皮下腫瘤動物模型并將荷瘤鼠分為GCV+5-FC治療組(GCV+5-FC組)、病毒對照組(ControlV組)和空白對照組(ControlO組)。GCV+5-FC組及ControlV組瘤體內(nèi)注射腺病毒，4天后RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因表達情況。GCV+5-Fc組給予前體藥物(GCV+5-FC)，ControlV組予生理鹽水，Con

11、trolO組給予前體藥物(GCV+5-FC)腹腔注射，觀察實驗組與對照組腫瘤體積變化及生存期差異。治療結(jié)束后5天各組隨即挑選裸鼠一只取腫瘤組織進行HE染色及TUNEL凋亡檢測，觀察其病理變化。 結(jié)果：腺病毒在體外能高效轉(zhuǎn)染T-24細胞，72小時轉(zhuǎn)染效率可接近100％。GCV和/或5-FC均能有效殺傷轉(zhuǎn)染后膀胱癌細胞，當給予相同濃度前體藥物時，聯(lián)合用藥組顯示出較強的腫瘤殺傷作用。0.5mg/mlGCV、0.1mg/ml5-FC和G

12、CV+5-FC作用于轉(zhuǎn)染后T-24細胞72小時細胞生存率經(jīng)統(tǒng)計分析表明72h后只加病毒的病毒對照組(ControlV組)與不加任何處理的空白對照組(ControlO組)細胞生存率無顯著差異(P=0.779)。GCV+5-FC組、5-FC組、GCV組與對照組比較均有顯著差異(P=0.000)。GCV+5-FC組與5-FC、GCV組間細胞生存率亦存在顯著差異(P=0.000)。細胞抑制率GCV+5-FC組較5-FC組及GCV組均高。而5-F

13、C組與GCV組之間無顯著差異(P=0.483)。旁觀者效應(yīng)較明顯，融合基因組明顯較強。生長于載玻片細胞經(jīng)治療后未見明顯凋亡小體，而利用Hoechst-PI雙染色法檢測經(jīng)前體藥物作用后轉(zhuǎn)染細胞，可見各組細胞均有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)，但聯(lián)合用藥組較單一用藥組凋亡現(xiàn)象增多。而ControlV組未見明顯凋亡細胞。體內(nèi)實驗表明：經(jīng)治療后GCV+5-FC組腫瘤體積明顯縮小，用藥后不同時間GCV+5-FC組、與ControlV組和ControlO組腫瘤體積比

14、較均存在顯著差異(P=0.000)。且生存期明顯延長。聯(lián)合用藥組可觀察到凋亡細胞，而對照組則幾乎無凋亡細胞可觀察到。 結(jié)論：CD-TK融合基因聯(lián)合應(yīng)用GCV和/或5-Fc在體外能有效殺傷膀胱腫瘤細胞，并存在較強的旁觀者效應(yīng)，其殺傷機制可能與凋亡有關(guān)。體內(nèi)實驗表明融合基因聯(lián)合前體藥物可明顯抑制裸鼠腫瘤生長，并可顯著延長荷瘤鼠生存期，但無法使腫瘤完全消退。本實驗證實CD-TK融合基因?qū)Π螂装┲委熡幸欢ㄐЧ?，但尚存在一定不足，需進一步