褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、第一部分：為了探討褪黑素(MEL)在血管新生方面的作用和可能的抗腫瘤血管新生機(jī)制，以體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型，觀察MEL對(duì)HUVECs增殖和凋亡的影響。第二部分：在第一部分基礎(chǔ)上，探討高濃度MEL抑制HUVECs增殖和促其凋亡的可能細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。 方法：1.原代培養(yǎng)HUVECs，免疫磁珠篩選后，并用免疫組化和電鏡鑒定內(nèi)皮細(xì)胞；MTT法測(cè)定不同濃度的MEL對(duì)HUVECs增殖的影響，并用流式細(xì)胞儀測(cè)定HUV

2、ECs細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況；免疫熒光、Westem Blot和RT-PCR檢測(cè)：MEL對(duì)HUVECs內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白P53、Bcl-2和Bax及其基因表達(dá)情況。2.在第一部分基礎(chǔ)上，KT-PCR檢測(cè)HUVECs褪黑素膜受體和核受體(MELR和RZR/ROR)的表達(dá)情況，以及MEL對(duì)其表達(dá)影響；檢測(cè)高濃度MEL對(duì)影響HUVECs增殖和凋亡的重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路RTK/ERK/P13K/AKT/PKC/NF-kB蛋白表達(dá)影響；應(yīng)用MELR受

3、體阻滯劑Luzindole、ERK1/2激活抑制劑U0126、P13K/AKT抑制劑LY294002以及PKC激活劑PMA和抑制劑GF 109203X，觀察其對(duì)高濃度MEL抑制HUVECs增殖和相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳遞通路的影響。 結(jié)果：1.(1)成功的分離培養(yǎng)原代HUVECs，免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長(zhǎng)并傳代，倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀，Ⅷ因子內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞免疫化學(xué)著棕色，電鏡下可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特征性的Weibel-Palade小

4、體。(2)極低濃度MEL(1nmol/L)對(duì)HUVECs增殖無(wú)明顯影響，但高濃度MEL(10nmol/L-1mmol/L)明顯抑制HUVECs增殖，并有濃度依賴傾向，1mmol/L抑制作用最明顯。(3)流式細(xì)胞儀顯示高濃度MEL 能明顯阻滯HUVECs細(xì)胞周期，能阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，引起“S期停滯”；凋亡分析顯示高濃度的MEL，能明顯促使HUVECs凋亡，lmmol/L時(shí)最明顯。(4)高濃度MEL(100nmol/L和lmmol/L)明顯

5、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因P53、Bax和Bcl-2的表達(dá)。(5)Westem Blot和免疫熒光檢測(cè)高濃度MEL促進(jìn)HUVECs凋亡與細(xì)胞內(nèi)P53和Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白下調(diào)有關(guān)。2.(1)正常HUVECs中褪黑素膜受體MELlaR和MELlbR都有明顯表達(dá)，而核受體家族中有RORa和RORb表達(dá)，以RORb表達(dá)更為突出，RORC幾乎無(wú)表達(dá)。(2)MEL受體參與MEL抑制HUVECs增殖機(jī)制，膜受體阻滯劑Luzindole只能部分阻

6、斷高濃度MEL的增殖抑制效應(yīng)。(3)外源性MEL可使HUVECs上MEL受體表達(dá)下調(diào)，此過(guò)程可能與PKCot表達(dá)上調(diào)有關(guān)。(4)ERK1/2、P13K/AKT和PKC信號(hào)通路與HUVECs增殖密切相關(guān)，其特異的通路抑制劑能明顯抑制HUVECs增殖。(5)高濃度MEL通過(guò)抑制ERKl/2、P13K/AKT和PKC信號(hào)通路抑制了HUVECs增殖和促其凋亡，相應(yīng)的通路抑制劑或激活劑能分別部分促進(jìn)或阻斷MEL抑制HUVECs增殖效應(yīng)。(6)ME

7、L抑制HUVECs中NF-kB的表達(dá)并抑制其和DNA結(jié)合，從而抑制HUVECs增殖和促其凋亡。(7)特異的ERKl/2、P13K/AKT和PKC信號(hào)通路抑制劑能不同程度的阻斷HUVECs中NF-kB的活性，和MEL作用類似，說(shuō)明MEL可通過(guò)抑制ERK1/2、P13K/AKT和PKC信號(hào)通路抑制NF-kB的活性，從而影響細(xì)胞增殖和凋亡。 結(jié)論：高濃度的MEL能明顯抑制HUVECs增殖和促其凋亡；高濃度的MEL抑制HUVECs的增殖