魚(yú)藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制研究.pdf

1、魚(yú)藤酮(rotenone)是一種廣泛使用的農(nóng)藥，近年來(lái)很多研究表明，魚(yú)藤酮作為一種環(huán)境致病因子在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。魚(yú)藤酮是細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ的特異性抑制劑，魚(yú)藤酮的毒性作用主要是通過(guò)抑制線(xiàn)粒體呼吸鏈的功能引發(fā)活性氧(ROS)產(chǎn)生增多所致。PD是一種以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。而多巴胺能神經(jīng)元較其他神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞系更

2、易受到魚(yú)藤酮的毒性作用而發(fā)生變性死亡。SH-SY5Y細(xì)胞是來(lái)源于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤，因其能產(chǎn)生和分泌多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)，已作為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞廣泛用于PD研究中。最新研究表明，DNA損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞周期關(guān)卡(check point)的異常調(diào)節(jié)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性丟失是PD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)有絲分裂后神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)神經(jīng)元變性

3、死亡的重要分子機(jī)制?？梢?jiàn)，細(xì)胞周期調(diào)控異常與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)，其重要作用正在受到越來(lái)越多人的關(guān)注。本研究的目的是觀(guān)察并研究魚(yú)藤酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制，探討?hù)~(yú)藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性死亡的方式和機(jī)制，為PD的發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。 本實(shí)驗(yàn)在魚(yú)藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型上得到了如下結(jié)果。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，魚(yú)藤酮可以時(shí)間和劑量依賴(lài)性的降低細(xì)胞存活率，臺(tái)盼蘭拒

4、染法結(jié)果顯示，250 nM魚(yú)藤酮呈時(shí)間依賴(lài)性增加的細(xì)胞死亡率，說(shuō)明魚(yú)藤酮引起了SH-SY5Y細(xì)胞的死亡。相差顯微鏡觀(guān)察到，魚(yú)藤酮引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞突觸縮回，形狀變圓。Hoechst33258染色顯示250 nM魚(yú)藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)了多核現(xiàn)象和凋亡樣特征。用生化方法檢測(cè)到250 nM魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的caspase-3活性增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，250 nM魚(yú)藤酮組G2/M期細(xì)胞比例先增加后降低，并隨后出現(xiàn)S期細(xì)胞比例增加和亞二倍體峰形成

5、，提示魚(yú)藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了短暫的G2/M期阻滯，G2/M：期去阻滯后細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期發(fā)生了畸形有絲分裂，導(dǎo)致異倍體細(xì)胞出現(xiàn)，形成亞二倍體峰細(xì)胞死亡。用Western blotting檢測(cè)到胞漿內(nèi)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin B1、磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白p-cdc2(Tyr15)的表達(dá)先增加，分別在250 nM魚(yú)藤酮處理6 hr和24 hr時(shí)達(dá)到高峰，之后表達(dá)降低，與細(xì)胞短暫性G2/M期阻滯相平行，說(shuō)明250 nM魚(yú)藤酮誘導(dǎo)了G2/M

6、期關(guān)卡調(diào)節(jié)子cyclin B1-p34cdc2復(fù)合物活性改變，從失活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，從而調(diào)節(jié)G2/M期關(guān)卡從阻滯變?yōu)槿プ铚?。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增加，提示魚(yú)藤酮可能通過(guò)依賴(lài)于p53途徑誘導(dǎo)G2/M期關(guān)卡的異常調(diào)節(jié)而致細(xì)胞的死亡。結(jié)論：魚(yú)藤酮誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞周期關(guān)卡的異常調(diào)節(jié)致使細(xì)胞發(fā)生死亡，可能是魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)元變性死亡的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)還觀(guān)察了魚(yú)藤酮對(duì)在體黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷作用，并

7、觀(guān)察了魚(yú)藤酮對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞周期的影響。我們采用大鼠黑質(zhì)單側(cè)注射魚(yú)藤酮的方法建立動(dòng)物模型，用苯丙胺誘導(dǎo)轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)篩選合格模型，用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析魚(yú)藤酮損傷后的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞周期的分布情況，發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮組神經(jīng)元S期細(xì)胞比例明顯增加，提示魚(yú)藤酮可能誘導(dǎo)了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元再次進(jìn)入細(xì)胞周期S期，而這有可能是導(dǎo)致有絲分裂后神經(jīng)元死亡的機(jī)制。動(dòng)物模型上觀(guān)察到的結(jié)果確證了魚(yú)藤酮對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞周期的作用。 手掌參是一種

8、傳統(tǒng)藏藥，具有補(bǔ)益氣血、安神增智等功效，CE是從其塊莖中提取得到的有效部位，4ab、4c、4e、4f是CE中的4個(gè)活性單體化合物。本課題組以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CE和4ab對(duì)H<,2>O<,2>、Aβ等造成的細(xì)胞損傷都有很好的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)在研究魚(yú)藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步評(píng)價(jià)CE 4個(gè)活性單體化合物對(duì)魚(yú)藤酮引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，4ab對(duì)魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞存活率降低有不同程度的保護(hù)作用，