廣譜caspase抑制劑抗小鼠接觸性皮炎的研究.pdf

1、目的：以Balb/c小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型及刺激性接觸性皮炎(ICD)模型，研究外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對皮膚炎癥反應(yīng)的抑制作用，觀察其對T細(xì)胞的作用，闡明抗炎機(jī)制，為研制新型抗皮膚炎癥外用藥物提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1.運用Franz垂直擴(kuò)散池進(jìn)行Z-VAD-FMK的體外透皮研究，高效液相色譜法(HPLC)檢測藥物含量；同時對其進(jìn)行體內(nèi)透皮研究，局部外用Z-VAD-FMK后

2、將皮膚離體，以乙二醇去除表皮，剩余組織經(jīng)液氮研磨組織勻漿，以液相色譜-串連質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測藥物濃度。
　　 2.以1-氟-2，4-二硝基苯(DNFB)制作經(jīng)典ACD小鼠模型，取激發(fā)后不同時間點對經(jīng)典ACD小鼠模型的評價指標(biāo)進(jìn)行探討。
　　 3.以DNFB制作初次ACD小鼠模型，數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量耳腫度隨時間的動態(tài)變化，ELISA方法檢測耳組織內(nèi)Th1細(xì)胞因子IL-2、INF-γ及Th2細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水

3、平，Real time RT-PCR方法檢測細(xì)胞因子mRNA水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞的增殖活性及表面活化標(biāo)記，從上述方面對初次ACD小鼠模型與經(jīng)典ACD小鼠模型進(jìn)行評價比較。
　　 4.以經(jīng)典ACD小鼠模型及初次ACD模型，觀察外用Z-VAD-FMK對ACD的治療作用、對ACD激發(fā)的抑制作用及對ACD誘導(dǎo)的抑制作用。
　　 5.以ELISA方法檢測Z-VAD-FMK干預(yù)ACD治療、ACD激發(fā)及ACD誘

4、導(dǎo)實驗中耳組織內(nèi)Th1細(xì)胞因子IL-2與INF-γ的表達(dá)水平，以real-time RT-PCR方法檢測耳組織內(nèi)IL-2 mRNA與INF-γ mRNA的水平。
　　 6.進(jìn)行小鼠局部淋巴結(jié)分析(LLNA)，以BrdU-流式細(xì)胞術(shù)檢測外用Z-VAD-FMK對耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響，以流式細(xì)胞術(shù)檢測其對T淋巴細(xì)胞活化的影響；
　　 7.以巴豆油制作小鼠ICD模型，觀察外用Z-VAD-FMK對ICD的抑制作用

5、。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外透皮研究中，在Franz垂直擴(kuò)散池供給池為20mM Z-VAD-FMK200μl、接收池為4ml0.9％NaCl、有效擴(kuò)散面積為1cm2的條件下，Z-VAD-FMK6h、12h及24h的透皮率分別為5.35％、15.52％及22.76％；體內(nèi)透皮研究中，間隔12h的2次外用2.5mM Z-VAD-FMK15μl后，其在耳組織中的濃度可達(dá)100μM，這與體外實驗中的有效濃度相近。
　　

6、 2.經(jīng)典ACD中，與激發(fā)后耳腫度一樣，激發(fā)后雙側(cè)耳重量之差與激發(fā)后組織切片顯微鏡下同一位置左右側(cè)耳雙面距離之差這2種客觀性更強(qiáng)的指標(biāo)亦顯示出一致的隨時間變化趨勢，即：激發(fā)后(1-2)d，炎癥程度達(dá)到高峰，隨后逐漸減弱，4d后已減至一半左右。
　　 3.初次ACD小鼠模型耳背部用藥6d后出現(xiàn)較明顯的耳腫度變化，這與經(jīng)典ACD模型自誘導(dǎo)至炎癥出現(xiàn)的時間相同；與經(jīng)典ACD小鼠模型相似，初次ACD模型的耳腫度亦呈現(xiàn)出隨時間變化的趨勢

7、：用藥后(7-8)d，耳腫度達(dá)到高峰，隨后逐漸減弱，9d后已減至一半左右；二者耳組織中的浸潤細(xì)胞均以單一核細(xì)胞為主；與正常對照相比，二者耳組織中Th1型細(xì)胞因子IL-2與INF-γ的表達(dá)均增加，其差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，而Th2型細(xì)胞因子IL-4均未增加，差別無統(tǒng)計學(xué)意義；與正常對照相比，二者耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞摻入的BrdU的熒光強(qiáng)度均增高，T淋巴細(xì)胞3種表面活化標(biāo)記(CD69、CD25及Ia)陽性細(xì)胞的百分率亦均升高，其差別均有統(tǒng)計

8、學(xué)意義。
　　 4.將Z-VAD-FMK外用于ACD小鼠模型，與陰性對照相比，激發(fā)后2h用藥、激發(fā)前用藥及誘導(dǎo)前用藥這3種情況下ACD觀察指標(biāo)均下降，其差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.上述3種情況下，與陰性對照相比，Z-VAD-FMK處理組耳組織中IL-2與INF-γ的表達(dá)均減少，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.LLNA中，與陰性對照相比，Z-VAD-FMK處理組耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞摻入的BrdU的熒光強(qiáng)度均

9、減弱，T細(xì)胞3種表面活化標(biāo)記(CD69、CD25及Ia)陽性細(xì)胞的百分率亦均下降，其差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 7.在干預(yù)ICD的實驗中，無論是治療研究還是預(yù)防研究，與陰性對照相比，Z-VAD-FMK處理組3個觀察指標(biāo)的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對皮膚有一定的通透性，為其作為皮膚外用藥物提供了可能。
　　 2.經(jīng)典ACD小鼠模型與初次ACD小鼠

10、模型均為Th1型免疫反應(yīng)，二者在臨床、組織病理學(xué)、組織中細(xì)胞因子表達(dá)及局部引流淋巴結(jié)中的表現(xiàn)均相似，可以互用，從而豐富了ACD小鼠模型，為研究抗炎、抗免疫新藥提供了新的模型選擇。
　　 3.外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以有效抑制ACD的發(fā)生，其對ACD的誘導(dǎo)及激發(fā)亦均有抑制作用。
　　 4.外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對巴豆油引起的ICD無明顯抑制作用，提示其抗刺激性炎癥的作用較弱。