宮頸癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突變分析和常見食源性致病菌快速檢測技術(shù)體系的建立.pdf

1、目的：核糖核酸酶(RNase)是降解RNA的酶類，核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)能和堿性RNase(AKR)結(jié)合而抑制其活性，從而減少RNA的降解。核糖核酸酶抑制因子(RI)是一種存在于細(xì)胞漿中的50KD的酸性蛋白質(zhì)，廣泛分布與哺乳動物的各種組織器官中，其中在人的胎盤中含量最為豐富。血管生成因子(angiogenin，Ang)是一種單鏈的堿性蛋白質(zhì)，分子量為14KD，屬于核糖核酸酶(RNase)

2、超家族的一員，其氨基酸序列與核糖核酸酶A有35﹪的一致性。血管生成因子主要催化18S和28S rRNA的有限水解，但它重要的生物學(xué)功能是具有誘導(dǎo)新血管網(wǎng)形成的作用。腫瘤生長依賴于其周圍新血管的生成，以便給其提供生長所需的必要物質(zhì)。RI是由7個亮氨酸重復(fù)序列排列折疊而成，每個重復(fù)單位含有一個短的β片層和一個長的α螺旋，β片層排列在馬蹄形的內(nèi)表面形成平行的β片層，而α螺旋裝飾外表面，7個亮氨酸重復(fù)單位有規(guī)律的環(huán)狀排列是N末端C末端在空間上較

3、為接近。RI可與RNase A以1:1化學(xué)計量比緊密結(jié)合，對其產(chǎn)生競爭性抑制作用，以極低的Ki值(4×10<'-14>mol/L)控制胞內(nèi)RNA水平。血管生成因子的氨基酸殘基組成與核糖核酸酶A(RNase A)具有35﹪的同源性，它們有著極其相似的空間結(jié)構(gòu)都可以作為配體與RI結(jié)合。而RI-Ang復(fù)合體的解離常數(shù)要比RI-RNase A復(fù)合體低約60倍。RI抑制腫瘤的機(jī)制目前認(rèn)為包括兩個方面：①RI能強(qiáng)烈抑制血管生成因子的血管生成活性。②

4、RI能阻斷腫瘤細(xì)胞對于血管生成因子的黏附，防止瘤細(xì)胞又黏附到血管生成因子上被帶到新生成的血管上。 結(jié)果：PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從普通瓊脂糖凝膠電泳可以看出正常人和宮頸癌患者都擴(kuò)增出了相應(yīng)的21個片段，電泳圖譜未顯示有差別。SSCP技術(shù)在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構(gòu)象。此次聚丙烯酰胺凝膠電泳盡量避免其影響因素，采用4﹪的聚丙烯酰胺凝膠以提高檢

5、出率。實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增的片段最小231bp，最大970bp。 結(jié)論：SSCP分析的結(jié)果顯示正常人與宮頸癌患者的核糖核酸酶抑制因子基因未發(fā)現(xiàn)其在遺傳學(xué)上的差異，但尚不能肯定其他腫瘤沒有發(fā)生突變。創(chuàng)新點(diǎn)： 1．首次對宮頸癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突變進(jìn)行了分析； 2．設(shè)計了全基因序列引物，共21對引物； 3．建立了SSCP分析核糖核酸酶抑制因子基因突變的最適條件。 據(jù)WHO估計，全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)十億

6、人，每年幾乎有二百萬兒童死于腹瀉，而大部分腹瀉是由被微生物污染的食品和水引起，其中66﹪以上是由細(xì)菌性致病菌所致。常見的食源性致病菌主要有沙門氏菌、空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌O<,157>:H<,7>、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌等。對上述食源性致病菌的檢測在一定程度上可以有助于其得到有效的控制；傳統(tǒng)的檢測程序復(fù)雜，所用試劑繁多，費(fèi)時費(fèi)力，靈敏度低，假陰性比較嚴(yán)重，已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代檢食品安全的要求。P

7、CR方法、實(shí)時熒光PCR方法、全自動免疫熒光方法等快速檢測方法是近年了發(fā)展起來的全新檢測技術(shù)，具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)。本研究著重于常見致病菌快速檢測方法體系的建立，并應(yīng)用于樣品的檢測；同時對于檢出的沙門氏菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，針對傳統(tǒng)的檢測方法鑒定到血清型后，依賴詳細(xì)評價陽性案例和一批適當(dāng)?shù)膶φ?，確定調(diào)查與特殊疾病的關(guān)聯(lián)因素，不能區(qū)分同一血清型不同菌株同源性的特點(diǎn)，本研究用脈沖凝膠電泳方法對其進(jìn)行分子分型，

8、為研究其流行病學(xué)特征和同源性提供分子生物學(xué)技術(shù)依據(jù)。 方法：①本研究采用PCR和實(shí)時熒光PCR技術(shù)，根據(jù)盡量避免假陰性(漏檢)的基本原則進(jìn)行靶基因的選擇。再依據(jù)盡量從理論上避免檢測的假陽性及假陰性并提高檢測靈敏度的原則來設(shè)計引物和探針。從基因序列庫中下載所有已經(jīng)公開發(fā)表的靶基因序列，運(yùn)用DNAStar軟件中的SeqMan和MegAlign模塊進(jìn)行排序比較。利用ABI Primer ExDress 2.0，DNAStarPrime

9、rSel ect等寡核甘酸設(shè)計軟件在保守區(qū)段設(shè)計多套引物和探針，確保引物之間、引物與探針之間不會形成穩(wěn)定的二聚體，然后在GenBank上做BLAST分析，確認(rèn)所設(shè)計的引物和探針與其它生物物種的基因序列不存在互補(bǔ)配對現(xiàn)象，然后進(jìn)行引物、探針篩選，針對8種食源性致病菌分別建立普通PcR和實(shí)時熒光PCR檢測體系并進(jìn)行優(yōu)化。②采用平板菌落記數(shù)的做為對照試驗(yàn)，以確定各個檢測方法的靈敏度。在獨(dú)立進(jìn)行的靈敏度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，每個稀釋梯度均與國標(biāo)法和行標(biāo)

10、法進(jìn)行了對照。③同時采用了對照菌株進(jìn)行了檢測方法的特異性實(shí)驗(yàn)。④運(yùn)用以上建立的方法，對雞胴體淋洗液樣品進(jìn)行沙門氏菌檢測；即樣品經(jīng)過前增菌和選擇性增菌后，分別采用4種不同的方法進(jìn)行檢測，即普通PCR方法、實(shí)時熒光PCR方法、免疫學(xué)方法(VIDAS)和傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法。⑤PFGE方法對分離到的7株鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行增菌，制成一定濃度的菌懸液后，制備瓊脂糖菌體包埋膠塊，用溶菌酶、蛋白酶K和TE緩沖液依次處理提取菌體DNA后，用限制性內(nèi)切酶

11、XbaI消化膠塊，再用脈沖凝膠電泳儀進(jìn)行DNA分子分型；同時使用全球統(tǒng)一參考菌株沙門菌Braonderup 血清型H9812，XbaI酶切，作為分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；對電泳后的圖譜，采用 BioNumerics 軟件對其同源性進(jìn)行聚類分析比較，菌株的同源性用相似性系數(shù)(矩陣)和百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果： ①建立了沙門氏菌、空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌O<,157>：H<,7>、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌以

12、及霍亂弧菌8種常見食源性致病菌的普通PCR和實(shí)時熒光PCR快速檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。其核心內(nèi)容包括靶基因的確定、特異性擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計和篩選以及擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化。 ②對所研制的8種常見食源性致病菌的普通PcR和實(shí)時熒光PCR快速檢測方法最優(yōu)反應(yīng)體系的靈敏度進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸提取法優(yōu)于直接煮沸法，其他的細(xì)菌沒有顯著性差異；實(shí)時熒光定量PCR檢出限數(shù)小于普通PCR，前者檢測體系的靈敏度可達(dá)到了10<

13、'2>cfu/mL左右；8種常見食源性致病菌中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌O<,157>：H<,7>和志賀氏菌的檢出限比較低；上述8種常見致病菌的檢測方法的靈敏度均優(yōu)于國標(biāo)法。 ③采用對照菌株測試了各個檢測體系的特異性，結(jié)果表明各個檢測體系對所有對照菌株都沒有陽性檢測信號產(chǎn)生，顯示其特異性極高，沒有出現(xiàn)一例非特異性的檢測結(jié)果。 ④應(yīng)用上述建立的方法，共檢測了56份雞胴體淋洗液樣品中的沙門氏菌，普通PCR檢出陽性樣品3

14、4份，實(shí)時熒光PCR陽性樣品36份，VIDAS陽性樣品28份；PCR和實(shí)時熒光定量PCR均無假陽性和假陰性結(jié)果。結(jié)果顯示該3種檢測方法均可以用于雞胴體中沙門氏菌的快速檢測。⑤針對以上檢出的鼠傷寒沙門氏菌，進(jìn)行菌體DNA經(jīng)酶切、脈沖凝膠電泳后，沙門氏菌參考菌株和每個待測菌株均出現(xiàn)了15條以上的條帶，圖譜經(jīng)軟件分析后結(jié)果顯示：FJ003號和FJ004號兩個菌株的相似度約為96.2﹪，F(xiàn)J001號和FJ002號相似度為95.8﹪，F(xiàn)J007號

15、和FJ001、FJ002號的相似度為83.8﹪，7個菌株彼此的相似度范圍為61.0﹪～96.2﹪。按照85﹪相似度的評定標(biāo)準(zhǔn)，同-血清型的7株鼠傷寒沙門氏菌可以分成5個型。PFGE具有分辨力高，是研究鼠傷寒沙門菌分子流行病學(xué)較好的基因分型方法。結(jié)論： 本課題成功建立了8種常見食源性致病菌一整套普通PCR和實(shí)時熒光PCR檢測方法，并且把實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件一致化，使之更具有可操作性；在靶基因選擇方面的有創(chuàng)新，設(shè)計了有自主知識產(chǎn)權(quán)

16、的引物和探針，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)；建立的快速檢測方法適用于多種國外食物微生物權(quán)威方法的前增菌液，同時即可用于篩選，又可用于確認(rèn)；特別適用于檢驗(yàn)檢疫、疾病控制、臨床診斷、產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)等對上述致病菌的檢測。 本次試驗(yàn)采用Xba Ⅰ酶作為鼠傷寒沙門菌染色體DNA的限制性內(nèi)切酶，產(chǎn)生的電泳條帶較理想，每株約產(chǎn)生16～25條電泳帶，說明本次試驗(yàn)所選用的限制性內(nèi)切酶和電泳條件適合鼠傷寒沙門菌的分型；按照85﹪相似度的評定標(biāo)準(zhǔn)，將7

17、株菌株分成5個型。本實(shí)驗(yàn)方法可以幫助確定同一血清型菌株之間的親緣關(guān)系。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1.成功建立了常見食源性致病菌的普通PCR和實(shí)時熒光PCR檢測方法，方法具有技術(shù)先進(jìn)、特異性好、靈敏度高、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，檢出限可達(dá)10<'2>cfu/mL，與傳統(tǒng)檢測方法相比，靈敏度提高了3個數(shù)量級； 2.新建立的方法已經(jīng)通過了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的審定： 3.方法中有自主知識產(chǎn)權(quán)的引物和探針序列； 4.方法中含8種常見的致病