大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端組織成牙能力的研究.pdf

1、哺乳動物牙根發(fā)育是一個長期的過程，包括：牙根發(fā)育啟動、牙根延長并建立牙周附著關系、牙齒萌出直至咬合關系建立、最后牙根發(fā)育完成、根尖孔閉合。在人類，牙根發(fā)育持續(xù)至牙齒萌出后的3－5年。然而，目前大量相關研究集中在牙根發(fā)育的啟動階段，對于牙根啟動后至發(fā)育完成這一長期而復雜的過程的研究非常少。然而在這一過程中，牙根進一步發(fā)育同時伴有牙周組織形成及牙周附著的建立，從而使牙根及牙周組織形成一個功能單位被錨定在頜骨上。因此，對于牙根發(fā)育啟動后至發(fā)育

2、完成這一時期的研究，特別是對牙根及牙周組織共同發(fā)育機制的探討是非常必要的。
　　牙根及牙周組織共同的發(fā)育依賴于發(fā)育期牙根的根端組織持續(xù)增殖并分化。在結構上，發(fā)育期牙根的根端組織包含雙層上皮細胞構成的鞘樣結構，即Hertwig上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS）。上皮根鞘將其下方的外胚間充質組織劃分為牙乳頭及牙囊，牙乳頭形成根部牙本質及牙髓，牙囊則形成牙周組織。盡管這個區(qū)域的細胞在構成上具

3、有異質性的特征，然而，存在于這三種成分間的相互作用及各自的功能對于建立結構完整的牙根／牙周復合體是必須的。因此，發(fā)育期牙根的根端組織似乎成為一個發(fā)育上的復合體，這個復合體由多種相互作用，密切相關的細胞類型構成的，我們將其命名為發(fā)育期牙根的根端復合體（developingapicalcomplex，DAC）。
　　本課題旨在通過對大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端復合體－DAC的組織學及細胞學觀察，探討DAC在原位的組織學特征，以及體外分離、培

4、養(yǎng)的DAC細胞的生物學特性，并進一步將DAC組織與細胞分別進行同種異體大鼠腎被膜下移植，明確DAC在體內是否具有繼續(xù)發(fā)育能力，以及分化成為牙根／牙周組織形成細胞并在體內形成牙根及牙周組織的能力，并初步探討了HERS在牙根及牙周組織共同發(fā)育中的作用。最后，我們還比較了DAC與牙根發(fā)育早期及牙根發(fā)育完成期根端組織的組織學、細胞學及成牙能力的差異，以明確DAC在發(fā)育學上的特征。
　　第一部分大鼠磨牙牙根發(fā)育期根端復合體－DAC在原位的組

5、織學觀察
　　實驗一、采用組織學方法系統(tǒng)觀察了牙根發(fā)育早期（PN8d），發(fā)育期（PN21d）及發(fā)育完成期（PN35d），SD大鼠下頜第一磨牙牙根發(fā)育過程中根端組織的組織學特征。同時應用免疫組織化學方法觀察了牙根發(fā)育不同時期，HERS的形態(tài)學特征。結果表明：PN8d時，SD大鼠下頜第一磨牙HERS開始形成，牙根發(fā)育啟動；牙囊包繞成釉器與牙乳頭。此時的根端組織包括牙乳頭、HERS及部分牙囊。牙囊與牙乳頭間有明確的組織學界限。PN21d

6、時，牙根發(fā)育接近一半，HERS在根旁已經斷裂，然而在牙本質根尖末端及上皮隔的部位仍然保持完整。此時牙囊僅存在于發(fā)育期牙根的根端，與牙乳頭相連，兩種組織間失去了牙根啟動時存在的明確的組織學界限，而成為一個組織結構上的整體，因此將其命名為發(fā)育期根端復合體。PN35d時，HERS完全斷裂并消失，牙根發(fā)育完成。
　　實驗二、采用組織學及免疫組織化學方法檢測了發(fā)育期牙根的根端復合體－DAC在原位的組織學特征。結果發(fā)現：DAC呈現出細胞濃聚的

7、現象，這種細胞濃聚有利于細胞－細胞，細胞－基質間相互作用，從而有利于組織形態(tài)發(fā)生；DAC包含大量具有高增殖活性的未分化間充質前體／干細胞，提示DAC較其鄰近的成體牙髓組織（dentalpulp,DP）具有更為“胚胎性”的特征；DAC表達多種牙本質，骨／牙骨質相關的礦化蛋白，提示DAC細胞不僅具有成牙本質細胞向分化的潛力，同時也具有成骨／成牙骨質向分化的潛力。
　　第二部分DAC細胞分離、培養(yǎng)和生物學特性的初步研究
　　實驗一

8、、采用顯微機械法分離了PN21d齡SD大鼠下頜第一磨牙根端復合體－DAC，并使用抗CK-14免疫組化染色觀察離體的DAC組織中是否包含HERS結構。并采用酶消化法分離培養(yǎng)了原代DAC細胞及牙髓細胞（dentalpulpcells,DP細胞）。結果發(fā)現：離體的DAC組織包含結構完整的HERS及間充質組織，表明本實驗使用的分離方法能夠完整分離DAC組織；原代培養(yǎng)的DAC細胞包含典型的上皮樣細胞及間充質樣細胞。間充質樣細胞接種后迅速貼壁，伸展

9、后呈長梭形或三角形。上皮樣細胞呈多角形，細胞連接緊密，聚集在一起呈克隆樣生長，細胞排列成鋪路石樣。間充質樣細胞分散在上皮樣細胞團周圍，使上皮樣細胞呈“島”樣分布。原代培養(yǎng)的牙髓細胞均為間充質樣細胞，細胞形態(tài)為長梭形或三角形，未見上皮樣細胞存在。
　　實驗二、采用細胞計數、BrdU摻入增殖細胞及流式細胞儀檢測細胞周期分布等方法，檢測了DAC細胞在體外的增殖能力，并與牙髓細胞－DP的增殖能力作了對比分析，從而明確DAC細胞在體外的增殖

10、特性以及發(fā)育期組織與成體組織細胞間增殖能力的差異。結果表明：DAC細胞的增殖能力顯著高于成體牙髓細胞，相比較，幾乎全部的牙髓細胞都處于靜息狀態(tài)。提示發(fā)育期組織來源的細胞較之成體細胞具有更高的增殖能力；此外，DAC作為成體環(huán)境中的發(fā)育期組織，具有“胚胎性”組織的特征。
　　實驗三、采用ALP活性檢測、礦化結節(jié)染色及RT-PCR檢測礦化相關基因表達的方法，檢測了原代培養(yǎng)的DAC細胞在體外的礦化及分化能力。使用牙髓細胞－DP作為對照，分

11、析了發(fā)育期組織與成體組織細胞間礦化及分化能力的差異。結果表明：DAC細胞在體外顯示了較牙髓細胞更高的礦化能力。并且高表達成牙本質細胞、成牙骨質／成骨細胞的標志基因，提示DAC細胞不同于牙髓細胞，不僅存在成牙本質細胞向的分化，也存在成骨／成牙骨質細胞向的分化。
　　第三部分DAC組織及細胞的體內種植研究及HERS作用的探討
　　實驗一、將離體的完整DAC組織與牙髓組織分別進行了同種異體大鼠腎被膜下移植，以明確DAC組織在體內是

12、否具有獨立發(fā)育能力，并且能夠重現有序的牙根及牙周組織形態(tài)發(fā)生。結果表明：DAC組織移植物在異位環(huán)境中重現了正確的牙根及牙周組織形態(tài)發(fā)生，形成了結構完整的，包含牙本質、牙骨質、牙周膜及骨樣組織的牙根－牙周復合體樣結構。提示DAC組織在異位環(huán)境下能夠繼續(xù)發(fā)育，并發(fā)育成為形態(tài)正確的牙根及牙周組織。牙髓組織移植物僅發(fā)育成為不規(guī)則的牙本質／牙髓復合體樣結構。
　　實驗二、將原代DAC細胞進行反復差別消化培養(yǎng)，獲得了純化的上皮細胞（HERS）

13、及間充質DAC細胞，經Westernblot鑒定排除了上皮與間充質細胞間的污染，并將包含HERS細胞的DACCs（HERS＋間充質細胞混合培養(yǎng)）與不包含HERS細胞的DACCs-M（僅間充質細胞），分別與陶瓷化牛骨（ceramicbovinebone,CBB）復合后進行同種異體大鼠腎被膜下移植，以探討HERS在牙根及牙周組織發(fā)育中的作用。結果表明：包含HERS細胞的DACCs移植物形成了形態(tài)良好的牙根及牙周組織樣的結構，包括牙本質、牙骨

14、質、牙周膜及骨樣組織。然而，去除了HERS細胞的DACCs-M移植物僅形成了沒有牙本質小管結構的骨樣牙本質，以及無規(guī)則排列的纖維樣組織。提示HERS在牙根及牙周組織發(fā)育中起重要的作用，同時也揭示了DAC作為一個功能性的整體在牙根及牙周組織共同發(fā)育中起作用，而DAC中每一種細胞成分對于牙根－牙周復合體的形成都是必需的。
　　第四部分DAC與牙根啟動期及完成期根端組織的對比研究
　　實驗一、采用顯微機械分離、酶消化法原代培養(yǎng)了D

15、AC細胞（PN21d）及牙根發(fā)育啟動期（PN8d）、發(fā)育完成期（PN35d）的根端組織細胞，并采用細胞計數、流式細胞儀檢測細胞周期分布、ALP活性檢測、礦化結節(jié)染色及RT-PCR基因表達檢測等方法對比了DAC細胞與牙根啟動期、完成期根端組織細胞，在體外細胞增殖、礦化及分化能力上的差異。結果表明：DAC細胞具有類似于牙根啟動期根端組織細胞的極高的細胞增殖能力；其礦化能力較牙根啟動期的根端組織細胞更高。并且這兩個時期礦化相關蛋白mRNA的表

16、達也存在差異，DAC細胞不僅表達牙根-牙周組織前體細胞的標志分子，還表達分化成熟的牙根-牙周組織形成細胞的標志分子。提示DAC中不僅存在形成牙根及牙周組織的前體細胞群，還包含分化成熟的牙根／牙周組織形成細胞。然而，DAC細胞在體外的極高的發(fā)育潛力在牙根發(fā)育完成期的根端組織細胞中不存在。
　　實驗二、將原代培養(yǎng)的DAC細胞、牙根啟動期及完成期根端組織細胞分別與CBB復合后進行同種異體大鼠腎被膜下移植，以探討DAC細胞與牙根啟動期、完