大鼠磨牙Hertwig上皮根鞘在牙根發(fā)育中作用的實驗研究.pdf

1、人類牙齒發(fā)育是一個連續(xù)的過程，經(jīng)歷了蕾狀期、帽狀期、鐘狀期和牙根發(fā)育期。牙冠發(fā)育完成以后，成釉器內(nèi)釉、外釉上皮在頸環(huán)處增生，向未來根尖孔方向生長，形成兩層上皮的鞘，被稱為Hertwig上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）。牙齒發(fā)育是外胚上皮和神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)相互作用的結(jié)果，而牙根是在HERS和周圍外胚間充質(zhì)的相互作用下形成的。HERS在牙根形成中可能起著以下作用：誘導牙乳頭細胞分化為成

2、牙本質(zhì)細胞，形成根部牙本質(zhì)；當根部牙本質(zhì)開始礦化時，HERS斷裂，牙囊細胞與HERS接觸被誘導分化為成牙骨質(zhì)細胞，生成牙骨質(zhì)；HERS還有可能直接參與牙骨質(zhì)的形成。 由于HERS在牙根發(fā)育中是暫時性結(jié)構(gòu)，而且僅由兩層上皮細胞構(gòu)成，細胞數(shù)量少且被外胚間充質(zhì)細胞包繞，故從牙胚中單獨分離HERS細胞相當困難。迄今為止，關(guān)于HERS細胞分離培養(yǎng)的報道還很少，HERS的生物學特性和在牙根發(fā)育中的具體作用都還不太清楚。本課題的目的是尋找牙

3、根發(fā)育中的合適時機，分離培養(yǎng)HERS細胞，進一步研究HERS的生物學特性和其在牙根發(fā)育中的作用，為牙根發(fā)育和組織工程牙根研究提供實驗和理論依據(jù)。本課題采用組織學、免疫組織化學、細胞培養(yǎng)、RT-PCR、體內(nèi)種植和體外培養(yǎng)等技術(shù)方法進行了以下四部分實驗研究，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 第一部分大鼠磨牙牙根發(fā)育中HERS的觀察 實驗一、采用組織學方法系統(tǒng)觀察了出生后（postnatal, PN）SD大鼠下頜第一磨牙牙根發(fā)育時序，

4、應(yīng)用免疫組織化學方法觀察了HERS在牙根發(fā)育中的生物學行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PN5d時，SD大鼠下頜第一磨牙HERS開始形成，牙根發(fā)育啟動；PN15d時，在根分叉和牙頸部，牙根硬組織形成，HERS斷裂；HERS發(fā)生斷裂時形態(tài)拉長，斷裂后呈圓形或立方形；PN35d時，HERS完全斷裂，牙根發(fā)育完成。 實驗二、采用免疫組織化學方法檢測了牙根發(fā)育中HERS和周圍外胚間充質(zhì)增殖活力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PN5d和PN7-8d時，HERS增殖力較

5、強；PN15d時，HERS末端保持較強增殖力，但牙胚頸部的HERS增殖力減弱，并發(fā)生斷裂；PN25d時，根尖處增殖細胞主要是間充質(zhì)細胞；HERS周圍的間充質(zhì)始終保持旺盛的增殖力。結(jié)果表明：HERS的斷裂可能是其增殖力減弱，周圍間充質(zhì)保持旺盛增殖力而產(chǎn)生的增殖力差異所致。綜合考慮HERS的生長、增殖力和實驗操作難度，PN7-8d是分離培養(yǎng)SD大鼠HERS細胞的適宜時機。 第二部分HERS細胞的分離、培養(yǎng)和生物學特性的初步研究

6、 實驗一、通過機械分離牙胚頸部組織，酶消化法原代混合培養(yǎng)，差別消化法去除成纖維樣細胞和角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的方法，分離培養(yǎng)并純化了SD大鼠HERS細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：本實驗分離的牙胚頸部組織僅包含牙乳頭、HERS和牙囊三種組織；原代培養(yǎng)細胞為混雜細胞，包括成纖維樣細胞和上皮樣細胞；經(jīng)3次差別消化和角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)，成纖維樣細胞被完全去除，剩余的貼壁細胞全部為上皮樣細胞；免疫細胞化學實驗證實上皮樣細胞為上皮來源細胞，RT

7、-PCR檢測顯示純化的上皮細胞中無間充質(zhì)細胞混雜。結(jié)果表明：我們獲得了純化的HERS細胞，為進一步研究HERS細胞的生物學特性奠定了基礎(chǔ)。 實驗二、通過掃描電鏡觀察、MTT檢測和RT-PCR等方法對HERS細胞的一些生物學特性進行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HERS細胞表面有發(fā)達的微絨毛和細胞連接；HERS細胞生長增殖較牙胚間充質(zhì)細胞緩慢；在礦化誘導條件下，HERS細胞可形成鈣鹽沉積；HERS細胞與成釉器細胞有所不同，除表達AMBN和

8、OCN外不表達其它牙齒礦化相關(guān)蛋白。結(jié)果表明：HERS細胞呈現(xiàn)典型上皮細胞表面結(jié)構(gòu)特征；HERS細胞雖來源于成釉器，但與成釉器細胞有所不同。 第三部分HERS細胞和牙胚頸部間充質(zhì)細胞的相互作用 實驗一、分別收集HERS細胞和牙胚頸部間充質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)液（conditioned media, CM），用于互相培養(yǎng)，MTT法測定生長曲線，觀察兩種細胞在生長增殖方面的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用HERS細胞的CM培養(yǎng)時，牙胚頸部間

9、充質(zhì)細胞的生長增殖無明顯變化；反之，用牙胚頸部間充質(zhì)細胞的CM培養(yǎng)時，HERS細胞生長增殖明顯加快。結(jié)果表明：HERS細胞對牙胚頸部間充質(zhì)細胞的生長增殖無明顯作用，反之，牙胚頸部間充質(zhì)細胞可促進HERS細胞的生長增殖。另外，本實驗成功建立了研究HERS和牙胚間充質(zhì)相互作用的實驗模型。 實驗二、通過ALP活性檢測、RT－PCR和細胞團體內(nèi)種植方法，分析HERS細胞CM培養(yǎng)對牙胚頸部間充質(zhì)細胞分化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HERS細胞CM

10、作用于牙胚頸部間充質(zhì)細胞，可使其ALP活性提高，DSPP、DMP1、BSP、OPN、OCN和ALP mRNA 表達增加，并且使其在體內(nèi)分化的成牙本質(zhì)細胞和形成的管狀牙本質(zhì)增多。結(jié)果表明：HERS可促進牙胚頸部間充質(zhì)細胞的分化。 第四部分HERS在牙胚和牙胚頸部組織的體內(nèi)種植和體外培養(yǎng)中作用的研究 實驗一、將PN7-8d的SD大鼠下頜第一磨牙完整牙胚植入母鼠腎被膜下，大網(wǎng)膜和皮下，4周后對種植牙胚進行組織學觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

11、植入的牙胚能夠在體內(nèi)種植部位發(fā)育出結(jié)構(gòu)較完整和形態(tài)較好的牙根和牙周組織,而且沒有明顯的免疫排斥和炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明：牙根可以在體內(nèi)異位環(huán)境下繼續(xù)發(fā)育，其關(guān)鍵可能在于選擇體內(nèi)種植牙胚的發(fā)育時機，即牙根發(fā)育已啟動的時機；HERS在牙根發(fā)育中起著重要作用，是牙根發(fā)育不可或缺的組織；利用母鼠體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)仔鼠牙胚組織，是研究牙齒發(fā)育和培養(yǎng)組織工程牙齒的理想動物模型。 實驗二、PN7-8d的SD大鼠下頜第一磨牙牙胚被分切成冠部和頸部兩部分

12、，分別通過流式細胞術(shù)測定細胞周期，并分別植入母鼠腎被膜下。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：絕大多數(shù)牙胚頸部細胞處于G0G1期，而許多牙胚冠部細胞進入S期和G2期；牙胚頸部組織在腎被膜下發(fā)育出結(jié)構(gòu)較完整和形態(tài)較好的牙根和牙周組織，而牙胚冠部則無此類發(fā)育現(xiàn)象。結(jié)果表明：PN7-8d的SD仔鼠下頜第一磨牙牙胚的頸部組織處于牙根發(fā)育前的準備期；牙根發(fā)育的基本組織是包括HERS在內(nèi)的牙胚頸部組織。 實驗三、體外立體培養(yǎng)PN7-8d的大鼠仔鼠下頜第一磨牙牙胚，觀

13、察牙胚發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：體外培養(yǎng)12d時，牙胚體積和結(jié)構(gòu)基本維持不變，但隨后牙胚發(fā)生萎縮；整個體外培養(yǎng)過程中，未見到牙胚繼續(xù)發(fā)育牙根。結(jié)果表明：本實驗成功構(gòu)建了出生后牙胚的體外立體培養(yǎng)模型，但可能由于牙根發(fā)育調(diào)控因素的復雜性，未能使牙胚在體外繼續(xù)發(fā)育牙根。 實驗四、使用不同的酶消化方法，將HERS離散為單個細胞或碎片，并和牙乳頭細胞、牙囊細胞一起離心形成細胞團，細胞團在體外培養(yǎng)4h后植入母鼠腎被膜下，4周后觀察組織發(fā)育情況。結(jié)

14、果發(fā)現(xiàn)：含有HERS碎片的細胞團形成了牙根和牙周組織樣結(jié)構(gòu)，含有離散HERS細胞的細胞團僅形成了管狀牙本質(zhì)。結(jié)果表明：HERS的雙層上皮結(jié)構(gòu)對引導正常牙根的發(fā)育具有重要作用，失去結(jié)構(gòu)的HERS引導牙根生成的能力是有限的。 實驗五、切取PN25d的SD大鼠的根端組織，植入母鼠腎被膜下，4周后觀察發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SD大鼠牙根根端組織在腎被膜下可發(fā)育出牙齒根尖樣的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：PN25d的SD大鼠磨牙根端組織仍具有形成牙根和