高胰島素處理相關(guān)核酸適體的篩選及基于核酸適體技術(shù)的胰島素檢測.pdf

1、第一部分、建立針對肝細(xì)胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)
　　 目的：建立針對肝細(xì)胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)，并獲得能識別肝細(xì)胞表面膜蛋白的核酸適體(Aptamer)。
　　 方法：設(shè)計DNA文庫，兩端各一段長20bp的引物序列，引物1用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothi

2、ocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記，引物2用生物素 biotin標(biāo)記，中間20bp為隨機(jī)序列。待培養(yǎng)皿(100mm)中人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2生長豐度達(dá)到95％左右時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用4℃洗滌緩沖液洗滌。取20nmole DNA文庫，溶于1ml結(jié)合緩沖液中，與細(xì)胞在4℃孵育1h后棄去上清液，洗滌緩沖液洗滌兩次后，用細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，用1ml蒸餾水洗滌，并將細(xì)胞懸液收集在1.5ml離心管中，在95℃加熱15min后離心，取上清液，此即首

3、輪篩選的母液，其內(nèi)包含與HepG2結(jié)合的序列。經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所得序列，擴(kuò)增后的產(chǎn)物為雙鏈DNA，包含目標(biāo)鏈及其互補鏈。將PCR產(chǎn)物與鏈親素(Streptavidin)覆蓋的瓊脂糖珠孵育后濾過上清液，用2％NaOH打開PCR雙鏈結(jié)構(gòu)，目標(biāo)鏈則溶解于NaOH溶液中，將該溶液通過NAP-5脫鹽柱脫去NaOH，測定單鏈DNA(ssDNA)濃度以確定該輪篩選終產(chǎn)物總量，并將其甩干。從上一輪篩選終產(chǎn)物中取100pmole，并將其溶

4、于500ul含有10％胎牛血清的結(jié)合緩沖液中，將其與培養(yǎng)皿(60mm)中生長豐度達(dá)到95％左右的HepG2細(xì)胞孵育，按照上述方法完成每一輪篩選。每3-5輪篩選后需要檢查每輪產(chǎn)物與細(xì)胞的結(jié)合情況。待細(xì)胞生長豐度達(dá)95％左右時，用非酶消化液消化細(xì)胞，將貼壁生長的細(xì)胞配成單個細(xì)胞懸液，用洗滌緩沖液洗滌后將細(xì)胞溶于結(jié)合緩沖液中，每5×105個細(xì)胞與25pmole的篩選產(chǎn)物于4℃孵育30min，篩選產(chǎn)物的濃度為250nM。同時將細(xì)胞與同等濃度的D

5、NA文庫孵育，作為陰性對照。孵育結(jié)束后洗滌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析篩選產(chǎn)物與細(xì)胞的結(jié)合程度。隨著篩選輪數(shù)的增加，產(chǎn)物與細(xì)胞間的結(jié)合程度越來越高，直至達(dá)到平臺期。選取結(jié)合程度最高的三輪產(chǎn)物進(jìn)行測序，所得序列即針對靶細(xì)胞的核酸適體。用DNA合成儀合成所得序列并用流式細(xì)胞儀檢測各條序列與靶細(xì)胞的結(jié)合程度，從而確定本篩選最終所得的核酸適體。分別用胰酶以及蛋白酶K處理細(xì)胞，處理時間從5min～30min不等，觀察酶處理前后各核酸適體與細(xì)胞結(jié)合的情況

6、。同時，將各核酸適體與不同種類的細(xì)胞孵育(包括LH86、Huh7、WT、IRS/KO、M7617、Ramos、CEM、H23、H69、A549、HBE、H661、TOV-21G、CAOV3等細(xì)胞)，觀察各序列的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：本文通過應(yīng)用SELEX對HepG2細(xì)胞展開篩選，經(jīng)過測序分析發(fā)現(xiàn)了4條針對HepG2細(xì)胞的核酸適體：IR01、IR03、IR04以及IR06。其中IR01、IR04與靶細(xì)胞的親和性最佳，其解離常數(shù)分

7、別為11.287±3.786nM和88.849±22.339nM；IR03雖然與HepG2細(xì)胞結(jié)合程度較低，解離常數(shù)較高(129.513±47.924nM)，但其特異性最好，能特異性與HepG2細(xì)胞結(jié)合，而與其它種類細(xì)胞幾乎無交叉反應(yīng)；IR01、IR04、IR06對大部分肝臟來源的細(xì)胞株均有較好結(jié)合；IR01是本實驗所得的核酸適體當(dāng)中與靶細(xì)胞結(jié)合程度最強的一條序列，其僅與肝臟來源的細(xì)胞有結(jié)合，而與其他組織來源的細(xì)胞無交叉反應(yīng)，并且該條核

8、酸適體與細(xì)胞的結(jié)合不容易被蛋白酶的作用所破壞。相反，IR03，IR04，IR06三條核酸適體與靶細(xì)胞的結(jié)合均容易被酶的消化而破環(huán)，胰酶或者蛋白酶K處理HepG2細(xì)胞5min后上述三條核酸適體與靶細(xì)胞的結(jié)合即被完全破壞。
　　 結(jié)論：通過SELEX，可以獲得與靶細(xì)胞高親和性以及高特異性結(jié)合的核酸適體，這些核酸適體通過識別靶細(xì)胞膜上所表達(dá)的某種生物分子從而達(dá)到識別表達(dá)相同生物分子的不同細(xì)胞株。
　　 第二部分、篩選針對肝細(xì)胞

9、表面與高胰島素處理相關(guān)膜蛋白的核酸適體
　　 目的：在第一部分實驗的基礎(chǔ)上篩選出針對肝細(xì)胞表面與高胰島素處理相關(guān)膜蛋白的核酸適體(Aptamer)。
　　 方法：待HepG2細(xì)胞生長豐度達(dá)70％左右后血清饑餓12h，然后分成四組，第一組繼續(xù)予以不含胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二組予以加入生理劑量的胰島素(0.1nM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，第三組予以加入高胰島素(100nM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，第四組予以加入超高胰島素(500nM)的培養(yǎng)基培

10、養(yǎng)。同時，予以高胰島素(100nM)處理胎鼠肝細(xì)胞野生型(Wild type，WT)與胰島素受體底物2基因(Insulin receptor substrate2，IRS2)敲除后的胎鼠肝細(xì)胞(IRS2/KO)，并設(shè)立正常培養(yǎng)組(不加入胰島素處理)作為對照。上述各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中均不含血清。24h后用非酶消化液消化細(xì)胞，將貼壁生長的細(xì)胞配成單個細(xì)胞懸液，用洗滌緩沖液洗滌后將細(xì)胞溶于結(jié)合緩沖液中，每5×105個細(xì)胞與濃度為250nM的核酸

11、適體25pmole于4℃孵育30min。孵育結(jié)束后洗滌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析各核酸適體與上述各細(xì)胞的結(jié)合程度在高胰島素處理前后有無變化。
　　 結(jié)果：IR04與HepG2細(xì)胞的結(jié)合明顯受到100nM胰島素的抑制；進(jìn)一步加大胰島素的劑量(500nM)則抑制作用更加明顯，經(jīng)過500nM胰島素處理后IR04與HepG2的結(jié)合幾乎被完全消減；但I(xiàn)R04與HepG2細(xì)胞的結(jié)合不受生理劑量胰島素的影響。同樣，高胰島素處理也能減弱IR04與W

12、T細(xì)胞的結(jié)合；但I(xiàn)R04與IRS2/KO細(xì)胞的結(jié)合程度不受高胰島素處理的影響。而IR01、IR03、IR06與細(xì)胞的結(jié)合均不受高胰島素處理的影響。
　　 結(jié)論：IR04與靶細(xì)胞的結(jié)合被高胰島素處理所減弱，且其減弱的程度與高胰島素的濃度呈正相關(guān)；但生理濃度范圍內(nèi)的胰島素不影響IR04與靶細(xì)胞的結(jié)合；IR04可能的靶標(biāo)為肝細(xì)胞表面某種與胰島素作用相關(guān)的膜蛋白，此種膜蛋白在高胰島素處理過程中被下調(diào)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究；IR04所

13、針對的靶物質(zhì)在人、鼠肝細(xì)胞的表達(dá)具有高度同源性，且其受高胰島素影響而發(fā)生下調(diào)的機(jī)理可能與人類相似。
　　 第三部分、基于核酸適體修飾石墨烯的胰島素檢測
　　 目的：應(yīng)用核酸適體修飾后的氧化石墨烯(GO)來進(jìn)行胰島素的檢測，并通過加入催化劑(DNA酶)來實現(xiàn)其檢測信號的放大。
　　 方法：將天然石墨粉和氯化鈉結(jié)晶研磨從而減小石墨顆粒的體積。去掉氯化鈉后，將研磨過的石墨粉加入到濃硫酸中，強力攪拌下加入高錳酸鉀，并用體

14、積分?jǐn)?shù)3％的雙氧水還原剩余的高錳酸鉀和二氧化錳，使其變?yōu)闊o色可溶的硫酸錳。在雙氧水的處理下，懸浮液變成亮黃色。最后，過濾、洗滌3次，然后超聲處理4h，離心后取上層溶液用于下一步實驗。
　　 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的胰島素核酸適體(insulin bindingaptamer，IBA)稀釋成100nM的胰島素緩沖液。將IBA與GO按照摩爾濃度1:1于室溫條件下混勻，避光孵育30min。此即本實驗的工作溶液。由于GO能淬滅吸

15、附在其表面的IBA所攜帶的熒光，此時溶液中僅存在一個較弱的熒光信號。當(dāng)溶液中存在胰島素時，與GO結(jié)合的IBA則從GO表面解離，與胰島素結(jié)合，F(xiàn)ITC標(biāo)記的IBA游離到溶液中，GO對FITC的淬滅作用大大減弱，從而使得溶液中的熒光信號增加；進(jìn)一步在工作溶液中加入DNA酶，加入不同濃度的胰島素(胰島素的加入量從5nM到50μM)后孵育2h。此時與胰島素結(jié)合的IBA將被DNA酶消化成片段，從而失去與胰島素結(jié)合的能力，胰島素重新游離于工作液中；

16、而與GO結(jié)合的IBA由于被GO保護(hù)，不被DNA酶消化，但將會從GO表面解離，并與游離的胰島素結(jié)合，從而被DNA酶消化成片段。理論上該反應(yīng)可以無限循環(huán)至IBA耗盡。終止反應(yīng)后檢測溶液中熒光濃度。同時設(shè)立陰性對照組(生物素、鏈霉親和素、牛血清蛋白)以明確上述胰島素檢測體系的特異性。
　　 結(jié)果：本實驗通過將胰島素核酸適體修飾在氧化石墨烯單層表面，成功構(gòu)建了胰島素的生物感應(yīng)器，實現(xiàn)了胰島素的便捷檢測，檢測下限為500nM；通過進(jìn)一步加