hHIF-1α基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞移植治療高動力性肺動脈高血壓的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　肺動脈高壓是以肺血管阻塞性病變導致肺血管阻力進行性升高為特征的嚴重肺血管疾病。其主要病理改變是外周肺小動脈中膜增生肥厚，肺小血管閉塞和肺細小動脈叢樣病變。而高動力性肺動脈高壓主要是由于體-肺分流的異常血流動力學引起，為先天性心臟病患者最常見的并發(fā)癥，也是影響患者生存和生活質(zhì)量非常重要的因素，隨著病情進展，臨床處理困難，致死率極高。目前擴血管藥物對肺動脈高壓治療的長期療效無法令人滿意，而干細胞移植的血管新生治療方式已

2、經(jīng)在各個疾病的研究領(lǐng)域取得了新進展。內(nèi)皮祖細胞是一類存在于外周血與骨髓中，并且能夠增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，它能夠結(jié)合到缺血或者損傷的內(nèi)皮部位參與新生血管的形成，另外內(nèi)皮祖細胞移植對于缺血缺氧性疾病治療的遠期療效已經(jīng)得到了證實。低氧誘導因子(HIF-1)是廣泛存在于體內(nèi)能夠參與血管新生的轉(zhuǎn)錄因子，在機體缺氧時能夠增加血管床的數(shù)量從而改善缺血缺氧，其生物活性主要取決于HIF-1α亞基。內(nèi)皮祖細胞和低氧誘導因子對于改善組織缺血缺

3、氧有協(xié)同作用，因此我們推測，在體外，通過慢病毒介導將HIF-1α轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細胞，高表達HIF-1α的內(nèi)皮祖細胞移植入體內(nèi)能夠協(xié)同參與新生血管的形成、減輕肺動脈高壓并且逆轉(zhuǎn)肺動脈血管重構(gòu)，從而為先天性心臟病肺動脈高壓患者未來的基因和干細胞治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.探討并構(gòu)建一種可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟的高動力性肺動脈高壓模型，并確定能夠成功建立可逆或者不可逆的肺高壓模型的時間，為肺高壓的進一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　

4、2.利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞并純化鑒定，為內(nèi)皮祖細胞移植提供條件。
　　3.構(gòu)建并鑒定人HIF-1α（hHIF-1α）慢病毒表達載體，慢病毒介導hHIF-1α體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞，確定最佳感染復數(shù)(MOI)及轉(zhuǎn)染效率并觀察轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細胞在低氧環(huán)境下的生長狀態(tài)和hHIF-1α的表達。
　　4.將高表達hHIF-1α的內(nèi)皮祖細胞經(jīng)靜脈途徑移植到高動力肺動脈高壓模型兔體內(nèi)，觀察肺血管血流動力學和肺組織病理變化

5、，探討單純內(nèi)皮祖細胞移植和高表達hHIF-1α的內(nèi)皮祖細胞移植對肺動脈高壓的不同影響，證實其對肺高壓治療作用的血管新生機制。
　　方法:
　　1.取1月齡新西蘭白兔進行頸總動脈-頸內(nèi)靜脈套管法和直接縫合吻合法兩種分流手術(shù)，比較兩種分流手術(shù)方式的優(yōu)缺點。手術(shù)后1、2、3、6和12個月，通過右心導管術(shù)分別測量肺動脈收縮壓和平均肺動脈壓，為了排除套管和縫合吻合的分流對肺動脈壓力的影響，我們在分流血管夾閉前后分別測定肺動脈壓力。稱量

6、右心室和左心室+室間隔重量，計算右心室和左心室+室間隔重量的比值[RV/(LV+S)]來評估右心室肥厚程度。動物處死后制作肺組織病理切片，HE染色觀察肺血管病理形態(tài)變化并通過Heath-Edwards分級方法進行評價，觀察術(shù)后不同時間段各組肺血管病理形態(tài)及Heath-Edwards分級情況，從而確定分流手術(shù)后導致的可逆或者不可逆肺動脈高壓形成的時間。
　　2.取新西蘭白兔雙下肢股骨骨髓，淋巴細胞分離液梯度離心后，取中間云霧狀單個核

7、細胞進行細胞培養(yǎng)，EGM-2內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)單個核細胞并進行傳代純化。體外培養(yǎng)細胞，觀察細胞不同時間的形態(tài)，通過流式細胞儀檢測培養(yǎng)細胞的CD34、CD133和VEGFR-2表面抗原表型，Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1熒光染色法鑒定細胞的雙吞噬功能。同時用CM-DiL標記細胞，觀察細胞標記率以及標記后對細胞生長的影響，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　3.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中hHIF-1α序列設(shè)計引物，以hHIF-1αc

8、DNA作為模板做PCR擴增，NheI和BamHI雙酶切重組克隆hHIF-1α質(zhì)粒和空白載體。參照Invitrogen公司ViraPower慢病毒包裝系統(tǒng)的方法進行hHIF-1α慢病毒的包裝，并測定慢病毒滴度。取培養(yǎng)2周的EPCs傳代于6孔板中，細胞生長滿意后進行病毒轉(zhuǎn)染。按照MOI值=0、5、10、20、50、100、200分別加入慢病毒液，同時加入Polybrene(8μg/ml)，置于37℃低氧培養(yǎng)箱中(1％O2，5％CO2和94％

9、N2)培養(yǎng)。培養(yǎng)48-96小時后倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，倒置熒光顯微鏡下觀察陽性細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率，確定最佳MOI值。轉(zhuǎn)染成功后，Westernblot檢測hHIF-1α在EPCs中的表達情況。
　　4.新西蘭白兔按照頸總動脈-頸內(nèi)靜脈吻合的方式建立高動力性肺動脈高壓模型，術(shù)后4、8和12周分別做超聲心動圖檢測吻合口的通暢度及心功能情況，12周后均通過右心導管術(shù)檢測肺動脈壓力。所有成功建立肺動脈高壓模型和假手術(shù)組的新西蘭

10、白兔被隨機分為6組，每組10只。假手術(shù)組:僅頸總動脈和頸內(nèi)靜脈分離;空白對照組:建立肺動脈高壓模型后不做任何處理;EPCs組:通過左側(cè)頸內(nèi)靜脈行單純EPCs移植;hHIF-1-EPCs組:通過左側(cè)頸內(nèi)靜脈行轉(zhuǎn)染后高表達hHIF-1α的EPCs移植;EPCs對照組:通過左側(cè)頸內(nèi)靜脈行轉(zhuǎn)染空載體的EPCs移植;培養(yǎng)基組:僅通過左側(cè)頸內(nèi)靜脈向模型兔注射EGM-2培養(yǎng)基。2周后通過右心導管術(shù)檢測血流動力學指標，處死動物后行肺組織病理切片，HE染

11、色觀察肺血管病理變化，計算肺小動脈的管壁厚度指數(shù)及相對管壁面積指數(shù)。冰凍切片行免疫熒光檢測觀察移植的EPCs在肺組織中的分布，Westernblot檢測肺組織hHIF-1α的表達。通過免疫組織化學染色檢測肺組織Ⅷ因子以觀察各組肺組織毛細血管密度，明確EPCs和轉(zhuǎn)染hHIF-1α的EPCs移植對肺血管數(shù)量的影響。
　　結(jié)果:
　　1.套管組建立模型從麻醉到結(jié)束的平均手術(shù)時間為1.40±0.12h，吻合組為1.48±0.21h。

12、套管組的死亡率為27.5％(11/40)，吻合組死亡率為12.5％(5/40)。手術(shù)后2個月至12個月，與假手術(shù)組相比，套管組和吻合組在分流血管夾閉前均有明顯增高的肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和RV/(LV+S)(P＜0.05)。雖然分流血管夾閉后，肺動脈壓力有所下降，但是肺動脈收縮壓和平均肺動脈壓力仍明顯增高于假手術(shù)組(P＜0.05)。而套管組和吻合組的肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和RV/(LV+S)無明顯差異。通過Heath-Edwar

13、ds分級發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，套管組和吻合組肺組織在術(shù)后3個月出現(xiàn)可逆肺動脈高壓病理改變，6個月后出現(xiàn)不可逆肺動脈高壓病理改變。
　　2.梯度離心法分離骨髓單個核細胞培養(yǎng)，24小時開始貼壁，培養(yǎng)7天后細胞可形成典型集落，2周以后即出現(xiàn)克隆性生長的EPCs。流式細胞儀檢測細胞表面CD34、CD133和VEGFR-2的陽性表達均占80％-95％，雙熒光染色可見90％的貼壁細胞都能夠特異性的攝取Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1

14、。CM-DiL標記細胞2天后，倒置熒光顯微鏡可見95％的細胞胞漿和胞膜均被染成紅色，少量次數(shù)傳代后紅色熒光無明顯衰減，并且標記對細胞生長無明顯影響。
　　3.hHIF-1α慢病毒表達載體構(gòu)建并包裝后，轉(zhuǎn)染293TN細胞可見明顯綠色熒光，測慢病毒滴度:hHIF-1α慢病毒為1.5×107TU/ml，對照空載體慢病毒為5×108TU/ml。不同MOI轉(zhuǎn)染EPCs后，用倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MOI=100時，轉(zhuǎn)染效率最高，

15、約為90％以上，并且細胞生長良好，無明顯死亡，多次傳代后能夠穩(wěn)定表達。慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs96小時后行Westernblot，轉(zhuǎn)染hHIF-1α的EPCs組可見hHIF-1α蛋白表達，未轉(zhuǎn)染和空載體對照組無hHIF-1α表達，證明hHIF-1α已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染至EPCs中。
　　4.hHIF-1α轉(zhuǎn)染的EPCs移植后2周，與假手術(shù)組相比較，空白對照組和培養(yǎng)基組肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和RV/(LV+S)明顯增高(P＜0.05)（假手術(shù)

16、組分別為:13.3±1.636mmHg，8.97±1.356mmHg和0.247±0.021;空白對照組分別為:35.4±2.066mmHg，23.1±1.331mmHg和0.436±0.034;培養(yǎng)基組分別為:35.9±2.132mmHg，23.4±1.389mmHg和0.433±0.026）。空白對照組和培養(yǎng)基組之間無明顯差異。與空白對照組相比，EPCs組和hHIF-1-EPCs組的肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和RV/(LV+S)明顯

17、降低(P＜0.05)（EPCs組分別為:24.5±4.301mmHg，17.3±2.908mmHg和0.353±0.056;hHIF-1-EPCs組分別為:15.4±1.897mmHg，10.3±1.515mmHg和0.278±0.029），但是hHIF-1-EPCs組比EPCs組降低更明顯(P＜0.05)。EPCs組和EPCs對照組之間無明顯差異。冰凍切片顯示肺組織巾EPCs組的EPCs可呈現(xiàn)紅色熒光，hHIF-1-EPCs組的EPC

18、s可呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)果顯示2周后移植的EPCs主要定位于毛細血管周圍和肺泡周圍，并且有的已經(jīng)形成了小血管樣明顯環(huán)狀結(jié)構(gòu)。肺組織Westernblot檢測，hHIF-1-EPCs組出現(xiàn)hHIF-1α特殊表達的條帶，其余組均未見明顯條帶出現(xiàn)。肺組織病理切片HE染色觀察，與假手術(shù)組相比，空白對照組和培養(yǎng)基組的管壁厚度指數(shù)和相對管壁面積指數(shù)明顯增大(P＜0.05)，但空白對照組和培養(yǎng)基組之間無明顯差異。與空白對照組相比較，EPCs組和hHIF-

19、1-EPCs組的管壁厚度指數(shù)和相對管壁面積指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，但是hHIF-1-EPCs組比EPCs組降低更明顯(P＜0.05)。EPCs組和EPCs對照組之間無明顯差異。免疫組織化學檢測Ⅷ因子，移植后EPCs組、hHIF-1-EPCs組和EPCs對照組毛細血管密度比空白對照組明顯增大(P＜0.05)（EPCs組:4.50±1.354/mm2;hHIF-1-EPCs組:8.20±1.814/mm2;EPCs對照組:4.30±1

20、.337/mm2;空白對照組:2.30±1.494/mm2），并且hHIF-1-EPCs組血管密度增大更明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.頸總動脈-頸內(nèi)靜脈吻合能夠成功建立可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟的兔高動力性肺動脈高壓模型，術(shù)后3個月左右可以形成可逆性肺動脈高壓，術(shù)后6個月以后可以形成不可逆肺動脈高壓。
　　2.利用密度梯度離心法可以體外分離骨髓來源的單個核細胞，并且通過EGM-2培養(yǎng)基能夠定向誘導、傳代獲取大量的純