受體酪氨酸激酶RON在大腸癌浸潤(rùn)-轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo).pdf

1、腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過程，它包括局部腫瘤生長(zhǎng)，浸潤(rùn)，擴(kuò)散到鄰近部位，并形成新病灶。腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤患者死亡率的主要決定因素。惡性腫瘤是人類死亡的第二大主要因素，而且有逐漸上升的趨勢(shì)，在有些發(fā)達(dá)國(guó)家，惡性腫瘤甚至已成為危害人類生命的頭號(hào)殺手。其中，消化系統(tǒng)的惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的60％～70％，結(jié)直腸癌和胃癌是常見惡性腫瘤。盡管胃腸腫瘤在手術(shù)、化療、放療、免疫和生物等各種治療方法上有了很大提高，但遺憾的是仍然有30％～5

2、0％患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。臨床早期胃結(jié)腸癌可以通過手術(shù)等有效治療達(dá)到根治，但大部分患者就診時(shí)，腫瘤已發(fā)生局部浸潤(rùn)或全身微轉(zhuǎn)移甚至轉(zhuǎn)移，治療后又缺乏一個(gè)有效的手段予以評(píng)估療效，檢控病情的發(fā)展，這是目前導(dǎo)致治療失敗的主要原因。所以如何預(yù)防和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移成為目前腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 腫瘤生物學(xué)及小分子藥物結(jié)構(gòu)領(lǐng)域，闡明腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)的分子生物學(xué)機(jī)制和發(fā)現(xiàn)、確認(rèn)關(guān)鍵靶點(diǎn)分子乃當(dāng)務(wù)之急。按Liotta等提出的癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的3步驟假

3、說，從分子水平上將這個(gè)過程分為：①粘附；②降解；⑨運(yùn)動(dòng)。腫瘤細(xì)胞的粘附性和遷移在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力影響其浸潤(rùn)周圍組織和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中運(yùn)動(dòng)因子起著重要作用。許多癌細(xì)胞表達(dá)運(yùn)動(dòng)因子受體，但關(guān)于運(yùn)動(dòng)因子與結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的研究極少。 在對(duì)上皮源性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，有一類被稱為受體酪氨酸激酶(RTKs)的跨膜蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和生存中起著基礎(chǔ)性作用。RON(Recepteurd'Origi

4、neNantais)是屬于MET原癌基因家族的一種酪氨酸激酶受體(RTK)。體外研究發(fā)現(xiàn)RON的激活引起上皮細(xì)胞的分化、遷移和基質(zhì)的侵襲，并可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 RONcDNA最早從角質(zhì)細(xì)胞中被克隆。此基因位于染色體3p21.3——一個(gè)在很多腫瘤中經(jīng)常發(fā)生突變的區(qū)域。RON是一個(gè)180kD的具有酪氨酸激酶活性的雜二聚體，由一個(gè)40kD的α鏈和一個(gè)150kD的跨膜β鏈組成。兩條鏈都是從同一個(gè)單鏈前體經(jīng)蛋白水解轉(zhuǎn)化而成

5、，并經(jīng)一個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起。巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MacrophageStimulationProtein，MSP)作為RON的唯一配體。有多篇研究顯示在人的上皮性腫瘤，如乳癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞性肝癌和頭頸部的鱗癌中均有不同程度的RON的高表達(dá)，并在其中部分腫瘤中檢測(cè)到變異體。 RON的高表達(dá)和變異體的出現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有何意義、其可能的相關(guān)機(jī)制是什么?本研究對(duì)此進(jìn)行探究，試圖尋找一種監(jiān)測(cè)評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移

6、和病情發(fā)展的特異性強(qiáng)敏感性高的指標(biāo)。 本論文的內(nèi)容分以下三部分：第一部分主要試劑配制方法和實(shí)驗(yàn)方法介紹試劑配制方法主要參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)。主要實(shí)驗(yàn)方法有：細(xì)菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒抽提；DNA瓊脂糖凝膠電泳；DNA和蛋白提取；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；WesternBlot；SiRNA；過河實(shí)驗(yàn)；Transwell趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)等。 第二部分RON受體酪氨酸激酶過表達(dá)在大腸癌細(xì)胞株浸潤(rùn)/轉(zhuǎn)移中的作用及分子

7、機(jī)制的研究 目的：1、觀察RON受體酪氨酸激酶過表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞株RKO遷移/浸潤(rùn)能力的影響。 2、探索RON過表達(dá)引起大腸癌細(xì)胞株移動(dòng)/浸潤(rùn)能力改變的具體分子機(jī)制及對(duì)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 方法：1、WesternBlot法篩選出低表達(dá)或不表達(dá)RON的結(jié)腸癌細(xì)胞株；檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后E-cadherin、Smad2的表達(dá)。 2、擴(kuò)增表達(dá)野生型RON的質(zhì)粒pDR2-wt-RON，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染篩選細(xì)胞，并

8、以WesternBlot法鑒定。 3、過河實(shí)驗(yàn)和Transwell趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)wt-RON的細(xì)胞株遷移和穿膜能力改變，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。 4、Matrigel基質(zhì)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞基質(zhì)浸潤(rùn)能力的變化。 5、構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)施RNAi，比較遷移、浸潤(rùn)能力的改變，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。 6、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒，針對(duì)RON實(shí)施RNAi。

9、 結(jié)果：1、成功篩選出不表達(dá)RON的結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO。 2、成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并選擇穩(wěn)定表達(dá)wt-RON的克隆，過表達(dá)wt-RON的細(xì)胞株形態(tài)改變，成長(zhǎng)梭型。 3、顯示過表達(dá)wt-RON的細(xì)胞株遷移和穿膜能力增強(qiáng)；基質(zhì)浸潤(rùn)能力增強(qiáng)；E-cadherin表達(dá)下降；Smad2的表達(dá)增高。 4、針對(duì)RON實(shí)施RNAi后，過表達(dá)wt-RON的細(xì)胞株的遷移能力和基質(zhì)浸潤(rùn)能力均下降；Smad2的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：1、

10、RKO細(xì)胞株轉(zhuǎn)染并過表達(dá)wt-RON后，細(xì)胞內(nèi)成分發(fā)生重構(gòu)，E-cadherin表達(dá)下降，形態(tài)梭型化，遷移和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)。提示通過上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT：Epithelial-MesenchymalTransition)機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的遷移/浸潤(rùn)能力增加。 2、過表達(dá)wt-RON的細(xì)胞株Smad2的表達(dá)增高，實(shí)施RNAi后，其遷移能力和基質(zhì)浸潤(rùn)能力均下降，Smad2的表達(dá)下調(diào)。說明可通過Smad途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。第三部分RON

11、受體酪氨酸激酶變異體在大腸癌浸潤(rùn)/轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制的研究 目的：1、觀察RON受體酪氨酸激酶變異體(RON△160)對(duì)大腸癌細(xì)胞株RKO遷移/浸潤(rùn)能力的作用。 2、探索RON△160表達(dá)引起大腸癌細(xì)胞株移動(dòng)/浸潤(rùn)能力增強(qiáng)的具體分子機(jī)制及對(duì)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 方法：1、WesternBlot法篩選出低表達(dá)或不表達(dá)RON的結(jié)腸癌細(xì)胞株；檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后E-cadherin、Smad2的表達(dá)。 2、

12、擴(kuò)增表達(dá)RON變異體(RON△160)的質(zhì)粒pcDNA3.1-RON△160，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染篩選細(xì)胞，并以WesternBlot法鑒定。 3、過河實(shí)驗(yàn)和Transwell趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)RON△160的細(xì)胞株遷移和穿膜能力改變，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。 4、Matrigel基質(zhì)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞基質(zhì)浸潤(rùn)能力的變化，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。 5、構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)施RNAi，

13、比較遷移、浸潤(rùn)能力的改變，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。 6、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒，針對(duì)RON實(shí)施RNAi后，WesternBlot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后E-cadherin、Smad2的表達(dá)。 結(jié)果：1、成功篩選出不表達(dá)RON的結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO。 2、成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并選擇穩(wěn)定表達(dá)RON△160的克隆，表達(dá)RON△160的細(xì)胞株形態(tài)改變，成長(zhǎng)梭型。 3、顯示表達(dá)RON△160的細(xì)胞株遷移和穿膜能力

14、增強(qiáng)；基質(zhì)浸潤(rùn)能力增強(qiáng)；E-cadherin表達(dá)下降；Smad2的表達(dá)增高。 4、針對(duì)RON實(shí)施RNAi后，表達(dá)RON△160的細(xì)胞株的遷移能力和基質(zhì)浸潤(rùn)能力均下降；Smad2的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：1、RKO細(xì)胞株轉(zhuǎn)染并表達(dá)RON△160后，形態(tài)變成長(zhǎng)梭型，E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞內(nèi)成分重構(gòu)，可增強(qiáng)遷移和浸潤(rùn)能力；提示通過上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT:Epithelial-MesenchymalTransition

15、)機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的遷移/浸潤(rùn)能力增加。 2、表達(dá)RON△160的細(xì)胞株Smad2的表達(dá)增高；實(shí)施RNAi后，遷移能力和基質(zhì)浸潤(rùn)能力均下降，Smad2的表達(dá)下調(diào)。變異體也可通過Smad途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。全文結(jié)論1.RKO細(xì)胞株轉(zhuǎn)染并過表達(dá)wt-RON后可增強(qiáng)遷移和浸潤(rùn)能力，此作用可為特異性SiRNA所阻斷。 2.過表達(dá)wt-RON通過上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞的遷移/浸潤(rùn)能力增加，上調(diào)Smad2表達(dá)。 3.RKO細(xì)胞