受體酪氨酸激酶RON在大腸癌浸潤-轉移中的作用機制及信號傳導.pdf

1、腫瘤的發(fā)展和轉移是一個多步驟的過程，它包括局部腫瘤生長，浸潤，擴散到鄰近部位，并形成新病灶。腫瘤的轉移和復發(fā)是腫瘤患者死亡率的主要決定因素。惡性腫瘤是人類死亡的第二大主要因素，而且有逐漸上升的趨勢，在有些發(fā)達國家，惡性腫瘤甚至已成為危害人類生命的頭號殺手。其中，消化系統(tǒng)的惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的60％～70％，結直腸癌和胃癌是常見惡性腫瘤。盡管胃腸腫瘤在手術、化療、放療、免疫和生物等各種治療方法上有了很大提高，但遺憾的是仍然有30％～5

2、0％患者出現(xiàn)復發(fā)和轉移。臨床早期胃結腸癌可以通過手術等有效治療達到根治，但大部分患者就診時，腫瘤已發(fā)生局部浸潤或全身微轉移甚至轉移，治療后又缺乏一個有效的手段予以評估療效，檢控病情的發(fā)展，這是目前導致治療失敗的主要原因。所以如何預防和檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤或轉移成為目前腫瘤研究的一個熱點。 腫瘤生物學及小分子藥物結構領域，闡明腫瘤轉移浸潤的分子生物學機制和發(fā)現(xiàn)、確認關鍵靶點分子乃當務之急。按Liotta等提出的癌細胞侵襲轉移的3步驟假

3、說，從分子水平上將這個過程分為：①粘附；②降解；⑨運動。腫瘤細胞的粘附性和遷移在腫瘤侵襲和轉移中起著極為重要的作用。癌細胞的運動能力影響其浸潤周圍組織和發(fā)生遠處轉移，其中運動因子起著重要作用。許多癌細胞表達運動因子受體，但關于運動因子與結直腸癌侵襲、轉移的研究極少。 在對上皮源性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，有一類被稱為受體酪氨酸激酶(RTKs)的跨膜蛋白質在調節(jié)細胞生長、分化和生存中起著基礎性作用。RON(Recepteurd'Origi

4、neNantais)是屬于MET原癌基因家族的一種酪氨酸激酶受體(RTK)。體外研究發(fā)現(xiàn)RON的激活引起上皮細胞的分化、遷移和基質的侵襲，并可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 RONcDNA最早從角質細胞中被克隆。此基因位于染色體3p21.3——一個在很多腫瘤中經(jīng)常發(fā)生突變的區(qū)域。RON是一個180kD的具有酪氨酸激酶活性的雜二聚體，由一個40kD的α鏈和一個150kD的跨膜β鏈組成。兩條鏈都是從同一個單鏈前體經(jīng)蛋白水解轉化而成

5、，并經(jīng)一個二硫鍵結合在一起。巨噬細胞刺激蛋白(MacrophageStimulationProtein，MSP)作為RON的唯一配體。有多篇研究顯示在人的上皮性腫瘤，如乳癌、結直腸癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、肝細胞性肝癌和頭頸部的鱗癌中均有不同程度的RON的高表達，并在其中部分腫瘤中檢測到變異體。 RON的高表達和變異體的出現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有何意義、其可能的相關機制是什么?本研究對此進行探究，試圖尋找一種監(jiān)測評估腫瘤浸潤、轉移

6、和病情發(fā)展的特異性強敏感性高的指標。 本論文的內(nèi)容分以下三部分：第一部分主要試劑配制方法和實驗方法介紹試劑配制方法主要參考《分子克隆實驗指南》(第三版)。主要實驗方法有：細菌轉化，質粒抽提；DNA瓊脂糖凝膠電泳；DNA和蛋白提?。毁|粒轉染；WesternBlot；SiRNA；過河實驗；Transwell趨化運動實驗；Matrigel基質浸潤實驗等。 第二部分RON受體酪氨酸激酶過表達在大腸癌細胞株浸潤/轉移中的作用及分子

7、機制的研究 目的：1、觀察RON受體酪氨酸激酶過表達對大腸癌細胞株RKO遷移/浸潤能力的影響。 2、探索RON過表達引起大腸癌細胞株移動/浸潤能力改變的具體分子機制及對Smad信號轉導途徑的影響。 方法：1、WesternBlot法篩選出低表達或不表達RON的結腸癌細胞株；檢測轉染前后E-cadherin、Smad2的表達。 2、擴增表達野生型RON的質粒pDR2-wt-RON，以脂質體法轉染篩選細胞，并

8、以WesternBlot法鑒定。 3、過河實驗和Transwell趨化運動實驗檢測過表達wt-RON的細胞株遷移和穿膜能力改變，未轉染細胞及載體轉染細胞作對照。 4、Matrigel基質浸潤實驗檢測轉染細胞基質浸潤能力的變化。 5、構建shRNA表達質粒，對轉染細胞實施RNAi，比較遷移、浸潤能力的改變，未轉染細胞及對照序列轉染細胞作對照。 6、脂質體法轉染siRNA表達質粒，針對RON實施RNAi。

9、 結果：1、成功篩選出不表達RON的結腸癌細胞株RKO。 2、成功轉染質粒并選擇穩(wěn)定表達wt-RON的克隆，過表達wt-RON的細胞株形態(tài)改變，成長梭型。 3、顯示過表達wt-RON的細胞株遷移和穿膜能力增強；基質浸潤能力增強；E-cadherin表達下降；Smad2的表達增高。 4、針對RON實施RNAi后，過表達wt-RON的細胞株的遷移能力和基質浸潤能力均下降；Smad2的表達下調。 結論：1、

10、RKO細胞株轉染并過表達wt-RON后，細胞內(nèi)成分發(fā)生重構，E-cadherin表達下降，形態(tài)梭型化，遷移和浸潤能力增強。提示通過上皮-間質細胞轉化(EMT：Epithelial-MesenchymalTransition)機制促進細胞的遷移/浸潤能力增加。 2、過表達wt-RON的細胞株Smad2的表達增高，實施RNAi后，其遷移能力和基質浸潤能力均下降，Smad2的表達下調。說明可通過Smad途徑進行信號轉導。第三部分RON

11、受體酪氨酸激酶變異體在大腸癌浸潤/轉移中的作用及分子機制的研究 目的：1、觀察RON受體酪氨酸激酶變異體(RON△160)對大腸癌細胞株RKO遷移/浸潤能力的作用。 2、探索RON△160表達引起大腸癌細胞株移動/浸潤能力增強的具體分子機制及對Smad信號轉導途徑的影響。 方法：1、WesternBlot法篩選出低表達或不表達RON的結腸癌細胞株；檢測轉染前后E-cadherin、Smad2的表達。 2、

12、擴增表達RON變異體(RON△160)的質粒pcDNA3.1-RON△160，以脂質體法轉染篩選細胞，并以WesternBlot法鑒定。 3、過河實驗和Transwell趨化運動實驗檢測表達RON△160的細胞株遷移和穿膜能力改變，未轉染細胞及載體轉染細胞作對照。 4、Matrigel基質浸潤實驗檢測轉染細胞基質浸潤能力的變化，未轉染細胞及載體轉染細胞作對照。 5、構建shRNA表達質粒，對轉染細胞實施RNAi，

13、比較遷移、浸潤能力的改變，未轉染細胞及對照序列轉染細胞作對照。 6、脂質體法轉染shRNA表達質粒，針對RON實施RNAi后，WesternBlot法檢測轉染前后E-cadherin、Smad2的表達。 結果：1、成功篩選出不表達RON的結腸癌細胞株RKO。 2、成功轉染質粒并選擇穩(wěn)定表達RON△160的克隆，表達RON△160的細胞株形態(tài)改變，成長梭型。 3、顯示表達RON△160的細胞株遷移和穿膜能力

14、增強；基質浸潤能力增強；E-cadherin表達下降；Smad2的表達增高。 4、針對RON實施RNAi后，表達RON△160的細胞株的遷移能力和基質浸潤能力均下降；Smad2的表達下調。 結論：1、RKO細胞株轉染并表達RON△160后，形態(tài)變成長梭型，E-cadherin表達下降，細胞內(nèi)成分重構，可增強遷移和浸潤能力；提示通過上皮-間質細胞轉化(EMT:Epithelial-MesenchymalTransition

15、)機制促進細胞的遷移/浸潤能力增加。 2、表達RON△160的細胞株Smad2的表達增高；實施RNAi后，遷移能力和基質浸潤能力均下降，Smad2的表達下調。變異體也可通過Smad途徑進行信號轉導。全文結論1.RKO細胞株轉染并過表達wt-RON后可增強遷移和浸潤能力，此作用可為特異性SiRNA所阻斷。 2.過表達wt-RON通過上皮-間質細胞轉化促進細胞的遷移/浸潤能力增加，上調Smad2表達。 3.RKO細胞