Bruton酪氨酸激酶在嚴重燒傷小鼠急性肺損傷發(fā)病中的作用和機制.pdf

1、一、研究背景
　　 嚴重燒傷會導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化。創(chuàng)傷應(yīng)激、熱力直接損傷、組織低灌注等因素會引起單核巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、血小板、內(nèi)皮細胞等炎細胞活化，促炎性細胞因子表達增多；血管內(nèi)皮細胞和白細胞受到強烈刺激后粘附分子表達及活化增強，而且隨著兩者粘附的加強，激活的白細胞出現(xiàn)呼吸爆炸、脫顆粒從而釋放出大量蛋白溶酶、活性氧、花生四烯酸等代謝產(chǎn)物及促炎細胞因子，造成血管內(nèi)皮細胞和其他組織細胞的廣泛損傷。上述病理生理過

2、程可概括為：嚴重燒傷-→促炎細胞因子表達增多-→白細胞與血管內(nèi)皮細胞(endothelialcell，EC)粘附激活、釋放大量炎癥介質(zhì)-→失控的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)。為了阻斷SIRS的發(fā)生和發(fā)展，近年來國內(nèi)外提出了一些針對單個細胞因子的治療，例如細胞因子的單克隆抗體和可溶性受體等，但在臨床試用均無明顯效果，甚至還有增加死亡的報道。分析其原因，主要是細胞因

3、子及其代謝產(chǎn)物種類眾多，構(gòu)成了一個十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，僅僅針對其中某一種或幾種進行干預(yù)，往往達不到目的。但細胞因子作用于靶細胞時所必須經(jīng)過的受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則屈指可數(shù)，如果著重研究炎性介質(zhì)過度釋放的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理，并對關(guān)鍵信號通路進行調(diào)控，對于阻斷嚴重燒傷時失控性的全身炎癥反應(yīng)可能較之于針對某一單個炎癥介質(zhì)更為有效。
　　 Toll樣受體(Toll-1ikereceptors，TLRs)是一類病原分子識別受體家族，它不僅能識別病原體

4、相關(guān)分子模式(PAMPs)，其某些成員，尤其是TLR4也可識別無菌性損傷后釋放的眾多內(nèi)源性分子即損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)。外源LPS或內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合后，活化MyD88和TRIF兩條信號途徑，前者活化NF-κB和MAPK信號通路，后者活化NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3信號通路。TLR4通過這些信號途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)包括細胞因子、趨化因子等，從而產(chǎn)生強有力的炎癥和免疫反應(yīng)。近年來研究表明，TLR4及其信號通路介導(dǎo)的天

5、然免疫在感染和非感染性疾病引起的局部和全身炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)過程中具有重要作用。
　　 Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton’styrosinekinase，Btk)是胞漿非受體酪氨酸蛋白激酶Tec家族成員之一，它是前B淋巴細胞發(fā)育所必需的。Btk的細胞表達譜較窄，僅限于髓系細胞，不表達于T淋巴細胞及組織漿細胞。Btk可增強TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并最終激活NF-κB和MAPKs信號通路，繼而啟動炎性基因表達。研究表明，Btk基

6、因突變或缺失的單核/巨噬細胞、肥大細胞和外周血單個核細胞對LPS刺激不敏感，TNF-α、IL-1β和iNOS表達明顯下降，進一步研究發(fā)現(xiàn)Btk對LPS誘導(dǎo)的細胞因子表達的調(diào)控作用主要是通過NF-κB和p38激酶介導(dǎo)的。目前關(guān)于Btk信號通路與炎癥關(guān)系的研究仍多限于體外觀察，它在體內(nèi)炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用仍知之甚少。
　　 臨床觀察表明，肺臟是燒傷后功能不全發(fā)生率最高和發(fā)生時間最早的器官。肺臟不僅是氣體交換的器官，也是一些細胞因子和

7、激素產(chǎn)生和滅活的場所，加上肺臟本身在解剖學(xué)上相對較脆弱，易受到各種致病因素的打擊，因此肺臟是燒傷后炎性損害的主要靶器官之一。由于失控的炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，Btk作為眾多炎性介質(zhì)合成與釋放的重要上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能在ALI的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。因此，本課題定位于肺組織，研究Btk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與嚴重燒傷早期炎癥調(diào)控的關(guān)系以及其與燒傷后肺臟損傷的關(guān)系。
　　 二、研究目的
　　 1.觀察Btk信

8、號通路在嚴重燒傷小鼠肺臟中的表達及活化情況，初步探討B(tài)tk信號通路在嚴重燒傷后急性肺損傷發(fā)病及局部炎癥反應(yīng)中的作用。
　　 2.觀察抑制Btk活化后，嚴重燒傷小鼠肺組織局部信號蛋白的動態(tài)變化情況，探討B(tài)tk在燒傷誘導(dǎo)的小鼠肺組織中MAPK和NF-κB及相關(guān)通路參與炎性肺損傷發(fā)病機制的可能效應(yīng)。
　　 三、研究內(nèi)容
　　 第一部分Btk激酶活化在燒傷后急性肺損傷發(fā)病中的作用
　　 健康成年的雄性C57BL/

9、6小鼠252只，隨機分為假燙對照組(C組)、燒傷組(S組)，燒傷+LFM-A13組(L組)。各組小鼠均予備皮、麻醉處置，S組、L組小鼠后軀干置98℃沸水中12s，復(fù)制30％TBSAⅢ°燙傷模型。L組在燒傷前1h及燒傷后6h，按4.2mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射LFM-A13，C、S組則予等量平衡液。按Parkland公式4ml/(kg*1％TBSA)計算總補液量，分別于傷后即刻、6h時相點分別腹腔注射總補液量50％的平衡液；C組不予燒傷及

10、補液。各組于傷后即刻、0.5h、1h、3h、6h和12h共6個時相點，各取6只小鼠的肺臟以10％中性福爾馬林液固定待病理檢查；各組另取6只小鼠行下腔靜脈取血處死后取肺臟，1×PBS漂洗后液氮凍存。再于術(shù)后12h，各組另取6只小鼠行下腔靜脈取血處死后取肺臟，以濾紙吸干表面滲液及血跡后稱重；再另各取6只小鼠從頸外靜脈注入1％伊文思藍，1小時后處死并灌洗肺循環(huán)，取左下肺待用。而后，全細胞裂解法提取各標本總蛋白后，Westernblot法檢測各

11、組各時間點肺組織中Btk蛋白、磷酸化Btk蛋白、Caspase-3和Bcl-2活性含量；采用Carraway雙盲病理評分，評價各組小鼠肺損傷程度；免疫組織化學(xué)法對各組小鼠肺組織Btk蛋白進行定位檢測；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測各組小鼠肺泡上皮細胞凋亡情況；肺干濕重比測定各組小鼠肺組織含水量；伊文氏藍比色法檢測各組小鼠肺微血管通透性。
　　 第二部分Btk激酶在燒傷后肺內(nèi)促炎性細胞因子表達和中性粒細胞浸潤中的作用

12、r>　　 采用第一部分敘述的方法制作動物模型，在燒傷后12小時取材，處理標本。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-蛋白含量；Trizol法提取肺組織總mRNA后，RealtimePCR法分析TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOSmRNA表達水平；測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性。
　　 第三部分Btk激酶參與燒傷后肺炎性損傷的分子作用機制
　　 采用第一部分敘

13、述的方法制作動物模型，在燒傷后即刻、0.5h、1h、3h、6h和12h共6個時相點，各組小鼠行下腔靜脈抽凈血處死，分離肺臟，1×PBS漂洗表面血跡后，無菌濾紙吸干殘液，液氮冰凍條件下研磨成粉狀，分裝于Eppendorf管，置-80℃冰箱保存。以全細胞裂解法提取各標本總蛋白，Westernblot法檢測各組各時間點的肺組織中磷酸化p38、磷酸化JNK、磷酸化ERK、IκBα、磷酸化IκBα蛋白的含量，探討B(tài)tk參與燒傷后肺炎性損傷的分子作

14、用機理。
　　 四、研究結(jié)果
　　 第一部分
　　 燒傷組小鼠肺臟的病理評分在燒傷后6h至12h一直顯著高于假燙傷對照組，而燒傷+LFM-A13組小鼠肺臟的病理評分雖高于假燒傷對照組，但較燒傷組顯著降低。Westernblot結(jié)果示，假燙對照組小鼠肺臟僅有少量Btk蛋白表達，而燒傷后30minBtk蛋白即有顯著增加，隨后仍持續(xù)增加，在6h達到高峰，并持續(xù)到12h；Btk磷酸化蛋白表達變化趨勢與其總蛋白表達一致。預(yù)

15、先應(yīng)用LFM-A13后，燒傷后各時間點Btk磷酸化蛋白表達均較燒傷組顯著降低。免疫組化結(jié)果表明，Btk蛋白表達主要限于單核/巨噬細胞和中性粒細胞等浸潤的炎性細胞。
　　 原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測及細胞凋亡指數(shù)(AI)顯示，假燙對照組基本未見凋亡細胞；燒傷組則凋亡最為明顯；燒傷+LFM-A13組可見凋亡，但較燒傷組明顯減少。Westernblot結(jié)果提示，與假燙對照組比較，燒傷組小鼠肺組織內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白活化型Cas

16、pase-3、抗凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2表達均顯著增加；燒傷+LFM-A13組小鼠Caspase-3表達較燒傷組明顯下降，Bcl-2表達則較燒傷組更為顯著。
　　 肺干濕重比及伊文氏藍比色法顯示，燒傷后12h時相點，燒傷組肺組織含水量及微血管通透性均較假燙對照組顯著增高，燒傷+LFM-A13組肺組織含水量及微血管通透性亦顯著高于假燙對照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 第二部分
　　 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)

17、果示，燒傷后12h，燒傷組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-水平均顯著高于假燙對照組；燒傷+LFM-A13組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NO2-/NO3-水平辦顯著高于假燙對照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 燒傷組小鼠在燒傷后12h其肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOSmRNA的表達量始終顯著高于假燙對照組；而燒傷+LFM-A13組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6和i

18、NOSmRNA的表達水平雖仍明顯高于假燙對照組水平，但卻顯著低于燒傷組。
　　 小鼠30％TBSAⅢ°燒傷后12小時，燒傷組小鼠肺組織的MPO活性顯著高于假燙對照組；燙傷+LFM-A13組MPO活性也顯著高于假燙對照組，但較燒傷組顯著降低。
　　 第三部分
　　 Westernblot法檢測各時間點肺組織中磷酸化p38、磷酸化JNK、磷酸化ERK、IκBα、磷酸化IκBα的表達量并比較發(fā)現(xiàn)，在燒傷后30min，p

19、38和ERK即發(fā)生明顯活化，而JNK在燒傷后3h才開始明顯活化；NF-KB在燒傷30min后即發(fā)生明顯活化，但其活化隨時間點推移逐漸減弱。而使用LFM-A13預(yù)干預(yù)后再給予燒傷刺激，與單純燒傷組比較發(fā)現(xiàn)，抑制Btk活化可顯著抑制燒傷后早期p38和NF-κB活化，但不影響JNK和ERK活化。
　　 五、研究結(jié)論
　　 (1)Btk特異性抑制劑可明顯抑制燒傷小鼠肺組織Btk活化，減輕Btk蛋白在單核/巨噬細胞及中性粒細胞等炎