線粒體ATP敏感的鉀通道開放對大鼠肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的作用研究.pdf

1、第一部分顯微鏡輔助下單人操作建立大鼠左單肺原位同種異體移植模型 目的：建立大鼠原位同種異體左單肺移植模型，為肺保存、肺缺血再灌注損傷(IRI)的研究提供動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法：32只SD雄性大鼠隨機(jī)配對成16對，分成2個時間點(diǎn)(2h和24h)，每個時間點(diǎn)8對(n=8)，平均體重為257．5~23．7g(230～300g)，采用三“袖套”管法單人操作成功建立大鼠原位同種異體左單肺移植模型，完成16例左肺原位移植。測定右頸動脈

2、的血?dú)夥治?，并同時測定左肺靜脈的血?dú)夥治鰜砹私庖浦卜畏喂δ堋?結(jié)果：16例大鼠左肺原位移植，失敗4例，成功率75．0％。術(shù)后再灌注2h右頸動脈的Pa02和左肺靜脈Pa02有顯著性差異(222．14~29．43mmHgvs146．71~35．35mmHg，P=0．001)，24h右頸動脈的Pa02和左肺靜脈Pa02有顯著性差異(217．20±32．59mmHgvs109．80±22．29mmHg，P<0．001)。術(shù)后再灌注2h、

3、24h右頸動脈的PaC02和左肺靜脈的PaC02差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(P>0．05)。 結(jié)論：利用自制的供肺固定裝置進(jìn)行供肺套管置入以及受體簡單的縫合三針牽引暴露進(jìn)行受體套接吻合建立大鼠肺移植模型，容易復(fù)制。肺移植術(shù)后動物模型生理狀態(tài)穩(wěn)定，能夠應(yīng)用于肺保存、肺IRI保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分目的：研究線粒體ATP敏感的鉀通道(mitoKATP)開放對大鼠肺移植術(shù)后IRI是否具有保護(hù)作用，為臨床治療肺移植術(shù)后肺IRI提供實(shí)驗(yàn)

4、基礎(chǔ)和理論依據(jù)，尋求一條可能的藥物治療途徑。 方法：采用第一部分大鼠左單肺同種異體原位移植方法建立動物模型。SD雄性大鼠120只，隨機(jī)配對成60對，分成5組，每組12對，分別為假手術(shù)組*(S組)：行左開胸術(shù)，但不行移植，從開胸至關(guān)胸時間控制于90min；生理鹽水對照組(C組)：單純行左肺原位移植并再灌注，術(shù)前給予0．5mi的生理鹽水腹腔注射；溶劑DMSO對照組木(DMSO組)：移植術(shù)前給予同等劑量溶劑DMSO腹腔注射；二氮嗪實(shí)驗(yàn)

5、組(DA組)：移植術(shù)前30min大鼠腹腔注射給予二氮嗪5mg／kg，加生理鹽水至0．5ml腹腔注射；5．羥基葵酸鹽復(fù)合二氮嗪組(HD．DA組)：移植術(shù)前45min給予5-HD腹腔注射，5mg／kg，15min后腹腔注射二氮嗪5mg／kg，30min后移植；再灌注后每組取兩個時間點(diǎn)(2h和24h)，每個時間點(diǎn)為6對(n=6)，分別檢測各時間點(diǎn)的右頸動脈及左肺靜脈血?dú)夥治觥⒎谓M織濕干重比(W／D)、血清和肺組織丙二醛(MDA)、總抗氧化能力

6、(T-AOC)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、ELISA定量檢測血清和肺組織腫瘤壞死因子．a(chǎn)(TNF-ct)及白介素．6(IL-6)、肺組織病理學(xué)檢查和超微電鏡檢查以及TUNEL法檢測肺細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 1．MitoKATP的開放劑二氮嗪的應(yīng)用能改善移植肺IRI后氧合功能的下降。 2．MitoKATP開放對于再灌注后毛細(xì)血管通透性的改善作用不十分明顯，病理評分未見有顯著提高，但形態(tài)學(xué)直接觀察可見損傷減輕。

7、 3．MitoKATP的開放能減輕組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制IRI時肺組織中性粒細(xì)胞(PMN)的聚集，提高機(jī)體的總抗氧化能力，提示mitoKATP的開放可以對肺IRI具有一定的保護(hù)作用。 4．在肺IRI中細(xì)胞因子的旁分泌、自分泌活性在肺IRI起著重要作用。mitoKATP的開放抑制細(xì)胞炎癥因子的分泌并減輕炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而防止肺移植術(shù)后IRI。 5．本實(shí)驗(yàn)觀察到肺IRI細(xì)胞凋亡是一個早期事件。MitoKATP的開

8、放能抑制2h時肺IRI的細(xì)胞凋亡。 第三部分目的：研究mitoKATP開放對大鼠肺移植術(shù)后肺組織TNF-ctmRNA、IL-6mRNA的影響以及核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-rB)的活性變化，探討其在IRI中可能的作用機(jī)制。 方法：動物模型和實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計同第二部分，采用實(shí)時定量PCR(RealTimePCR)進(jìn)行肺組織TNF-t~mRNA、IL-6mRNA表達(dá)量的相對定量。ELISA檢測NF-rd3的活性。 結(jié)果

9、： 1．DA組和C組再灌注2h肺組織TNF-amRNA比較有顯著性差異(17．004-1．50E-5vs30．82+1．37E-5，P<0．05)，24h后DA組和C組比較有顯著性差異(4．34-4-0．79E-5vs8．13+0．95E-5，P<0．05)。阻斷后HD-DA組和DA組再灌注2h肺組織TNF-amRNA比較有顯著性差異(28．75~1．96E-5vsU．89~0．80E-5．P<0．05)，24h后HD-DA組和

10、DA組比較有顯著性差異(8．30~0．74E-5vs6．02~0．54E-5P<0．05)。 2．DA組和C組再灌注2h肺組織IL-6比較有顯著性差異(0．052~0．007vsO．138~0．015，P<0．05)，24h后DA組和C組比較無顯著性差異(0．036~0．003vs0．041~0．005，P>0．05)。阻斷后HD-DA組和DA組再灌注2h肺組織IL-6比較有顯著性差異(O．151~0．009vs0．052~0．

11、007，P<0．05)，24h后HD-DA組和DA組比較無顯著性差異(0．042~0．005vs0．036~0．003，P>0．05)。 3．DA組和C組再灌注2h肺NF-rB活性比較有顯著性差異(0．49~0．08vs1．84+0．20，P<0．05)，24h后DA組和C組比較有顯著性差異(0．51±0．09vs1．08士0．17，P<0．05)。阻斷后HD-DA組和DA組再灌注2h肺NF-κB活性比較有顯著性差異(1．93士

12、0．13vs0．494-0．08，P<0．05)，24h后HD-DA組和DA組比較有顯著性差異(1．11±0．18vs0．51±0．09，P<0．05)。 結(jié)論： 1．再灌注后NF-rd3活性顯著升高，提示IR能引起NF-KB活性變化。MitoKATP開放后NF-rd3活性有顯著下降，并能被5-HD阻斷，提示mitoKATP開放能抑制NF-κB的活化。 2．再灌注后不同時間點(diǎn)各組的TNF-amRNA升高明顯，和T

13、NF-a蛋白水平相一致，提示和NF-r．B的活化相關(guān)。mitoKATP開放后TNF-amRNA下降明顯，但和蛋白水平的TNF-α完全阻斷不一致。mitoKATP開放能通過抑制NF-κB啟動而影響TNF-ttmRNA，但可能還有其他因素影響其轉(zhuǎn)錄。 3．IL-6mRNA再灌注2h后升高明顯，與前一章節(jié)中IL-6蛋白水平相一致，和NF-,d3的活化相關(guān)，mitoKATP開放后2h的IL-6mRNA下降明顯，提示其作用可能通過抑制NF