鏈親和素標記的腫瘤壞死因子α治療表淺膀胱癌的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤之一,美國癌癥協(xié)會2009的統(tǒng)計顯示:在男性全身惡性腫瘤的新發(fā)病例中,膀胱癌居第4位,死亡率居第8位。新發(fā)膀胱癌病例中90％以上為移行上皮細胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder,TCC),其中約75％為表現(xiàn)表淺膀胱癌,此類病例多行經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(TURBT),單純腫物切除術后,2/3病例會在5年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復發(fā)并出現(xiàn)腫瘤分期的進

2、展。因此術后常規(guī)輔以膀胱灌注治療,灌注藥物多選擇化療藥(絲裂霉素；表柔吡星等)、生物免疫制劑(卡介苗)等。但仍有相當一部分患者對于術后輔助治療表現(xiàn)為不應答,從而出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)進展。
　　 因此,可以認為膀胱癌術后輔助治療是預防復發(fā)的關鍵問題之一,目前生物免疫治療又是腫瘤治療研究的熱點與重點之一,因此尋找高效、毒副作用低的術后輔助新療法,特別是是能誘導長期免疫保護作用,是臨床表淺膀胱癌治療中急需解決的問題問題之一。目前膀胱癌生物免

3、疫治療所用最多及時間最長的藥物為:卡介苗(BCG),但臨床研究表明仍有30％～40％對BCG療法無應答,在治療有效的病例中,其副作用又進一步制約了其更為廣泛的應用。因此,人們設想能過膀胱灌注其它生物免疫制劑,以達到預防復發(fā)的目的。其中細胞因子如GM-CSF、TNF-α和IL-2等進行膀胱灌注給藥,取得了一定的療效。但是,缺乏修飾的重組細胞因子在人體內(nèi)不夠穩(wěn)定,同時由于膀胱特殊的解剖結構,使其很快被尿液所稀釋,排出,因此極大的限制了其療效

4、的發(fā)揮。為了克服這些不足常需增加劑量和用藥次數(shù),隨即其增加了副作用。
　　 于是,有學者開始研究將細胞因子通過一些方法更加牢固地結合在膀胱黏膜,最常用的是原位基因轉染(或轉導)的方法,在腫瘤病灶局部實現(xiàn)免疫激活因子持續(xù)有效表達。但是,表淺膀胱癌原位基因轉染(或轉導)有其固有的缺陷:效率一般較低,致使治療基因的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物的有效濃度在腫瘤病灶局部難于達到并較長時間地維持；還存在潛在的病毒載體安全性問題(所謂“遺傳毒性”)和免疫原

5、性問題(反復使用同一病毒載體會影響導入基因的表達效率)。我們利用一種新的蛋白質(zhì)錨定技術,該技術的主要原理為:充分利用了細胞表面蛋白質(zhì)的氨基易生物素化以及生物素與鏈親和素高效而強有力幾乎不可逆的結合這兩個特性。利用這個蛋白質(zhì)錨定技術平臺,可在膀胱黏膜細胞進行快速表面修飾,使免疫刺激因子迅速永久地錨定在細胞的表面、并能使這些已錨定的免疫刺激因子仍保持它們的生物活性。
　　 鏈親和素標記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)原位錨定治療表淺膀

6、胱癌的方法目前尚無相關報道。本研究將鏈親和素標記的細胞因子錨定于膀胱細胞表面,探求該方法的可行性與有效性,為鏈親和素標記的雙功能蛋白分子治療表淺膀胱癌進一步臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。
　　 目的：
　　 探討經(jīng)腹超聲在小鼠膀胱癌腫瘤進展中應用的價值。探討SA-TNF-α治療實驗性小鼠表淺膀胱癌的療效及其相關機制。探討SA-hTNF-α治療的免疫保護作用。
　　 方法：
　　 1、經(jīng)腹超聲在小鼠膀胱診斷中

7、的應用:共55只小鼠。分為兩組:10只小鼠Ⅰ組(動態(tài)監(jiān)測),另35小鼠和10只作為對照的正常小鼠為Ⅱ組(腫瘤診斷)Ⅰ組膀胱腫瘤種植后第3天至21天行超聲監(jiān)測腫瘤發(fā)生情況及大小進展。Ⅱ組在腫瘤細胞種植7～10天后經(jīng)腹行雙盲超聲腫瘤診斷,觀察膀胱內(nèi)腫瘤的形成及大小,同時處死小鼠行病理檢測。
　　 2、膀胱黏膜錨定SA-hTNF-α時間6只雌性C57BL/6j小鼠,0.6％戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉,在無菌操作下用靜脈

8、留置針行尿道插管。經(jīng)留置針行1.25 mmol/L Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素化試劑進行膀胱灌注(0.1ml/只),留置30 min,無菌PBS沖洗膀胱3次,膀胱內(nèi)灌注SA-hTNF-α(100ng/ml,0.1ml/只)后1d、5d、7d,分別隨機處死2只小鼠,取膀胱進行行冰凍切片,免疫組化分析。觀察SA-TNF-α錨定修飾膀胱黏膜后在黏膜表面存留的時間。
　　 3、SA-hTNF-α原位錨定膀胱黏膜對表淺膀

9、胱癌的治療研究 雌性C57BL/6小鼠110只,隨機分成5組,正常未處理組(空白對照組)、PBS對照組、可溶hTNF-α治療組、SA-GFP錨定組、SA-hTNF-α錨定治療組,每組22只,實驗組小鼠用PBS灌洗膀胱后灌注100μl NHS-PEO4-Biotin(1.25 mmol/L)進行生物素化30分鐘,再次PBS灌洗3次沖沈掉多余生物素,然后膀胱灌注100μl hTNF-α(100ng/ml),留置靜脈留置針1h；PBS對照組不

10、能行生物素制劑灌注,直接膀胱灌注PBS0.1ml；可溶hTNF-α治療組行生物素化制劑灌注,直接膀胱灌注SA-hTNF-α。每4天重復一次治療,共行6次治療,最后一次治療結束后第6天,各組行膀胱超聲檢測。同時各組隨機選取2只小鼠,處死,行膀胱冰凍切片免疫組組織化學檢測膀胱腫瘤中CD4+T及CD8+T,并取脾細胞行細胞毒性T淋巴細胞實驗(CTL)。
　　 4、SA-hTNF-α原位錨定治療后的免疫保護作用 腫瘤膀胱種植60d后,取

11、SA-hTNF-α未荷瘤的小鼠皮下接種MB49細胞1×106個,同時設立對照組。
　　 結果
　　 1、超聲診斷相對病理金標準,其靈敏度為:94.12％,特異度為:90.91％,假陽性率:9.09％,假陰性率:5.88％。超聲檢查與病理兩種診斷方法結果的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.625)。兩種診斷方法的吻合度較強(κ=0.773,P=0.000)。超聲可于腫瘤種植第3天觀察到膀胱腫瘤生長。
　　 2、錨定SA-h

12、TNF-α在膀胱黏膜上維持時間 膀胱黏膜生物素化并灌注SA-hTNF-α后第1、5、7天,處死小鼠,取出膀胱,行冰凍切片,免疫組化分析。結果顯示:SA-hTNF-α灌注后,SA-hTNF-α錨定在膀胱的黏膜上,并且能夠穩(wěn)定維持至少7 d。
　　 3、觀察腫瘤種植后60 d,PBS對照組全部死亡；SA-GFP治療組有2只小鼠存活(2/22)；可溶性hTNF-α治療組有7只小鼠存活(7/22);SA-hTNF-α錨定治療組有18只小

13、鼠存活(18/22),其中9只小鼠無瘤存活。SA-hTNF-α錨定治療組存活時間與其他3組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。各組間小鼠行超聲檢查后,其腫瘤體積之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。SA-hTNF-α錨定治療組膀胱及腫瘤組織CD4+T及CD8+T陽性細胞數(shù)高于對照組,其差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001),SA-hTNF-α錨定治療組細胞毒性T淋巴細胞實驗(CTL)細胞殺傷率高于對照組,其差異具有統(tǒng)計學意義(

14、P=0.000)。
　　 4、對無瘤存活的9只小鼠和9只正常未處理小鼠再次膀胱灌注MB49細胞60 d后,SA-hTNF-α錨定治療組仍有5只小鼠存活(5/9),與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 結論
　　 經(jīng)腹超聲可以有效的監(jiān)測實驗性小鼠膀胱腫瘤的發(fā)生及進展。SA-hTNF-α可在活體小鼠膀胱黏膜穩(wěn)定錨定修飾較長時間。SA-hTNF-α錨定修飾治療表淺膀胱癌可顯示較好的療效,此治療策略可增