乳腺癌線粒體DNA突變和拷貝數(shù)改變的研究.pdf

1、目的:該文首先通過(guò)對(duì)兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的研究建立線粒體DNA的D-loop區(qū)基因突變和線粒體DNA拷貝數(shù)改變的檢測(cè)方法;其次通過(guò)測(cè)定乳腺癌患者組織和外周血以及家族性乳腺癌家系成員外周血線粒體基因組D-loop區(qū)突變的頻率和分布研究這些突變產(chǎn)生的機(jī)制及在腫瘤發(fā)生中的作用;此外,進(jìn)一步對(duì)這些標(biāo)本線粒體DNA拷貝數(shù)改變進(jìn)行了分析,探討了線粒體DNA的D-loop區(qū)的突變和拷貝數(shù)改變與乳腺癌發(fā)生及與遺傳性乳腺癌易感

2、性的關(guān)系.方法:第一部分:體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231,從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中提取線粒體DNA,PCR擴(kuò)增線粒體DNA的D-loop區(qū),與T載體連接后在大腸桿菌DH5 α中克隆,測(cè)序分析突變;以含有D-loop區(qū)的T載體為標(biāo)準(zhǔn),用real-time實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增兩個(gè)細(xì)胞系線粒體DNA的D-loop區(qū)以檢測(cè)線粒體DNA的絕對(duì)拷貝數(shù).第二部分:取30例乳腺癌組織標(biāo)本、30例乳腺癌患者的外周全血標(biāo)本、42例遺傳性乳腺癌

3、家系成員的外周全血標(biāo)本和30例健康獻(xiàn)血員的外周全血標(biāo)本,采用E.N.Z.A Tissue和Blood DNA試劑盒分別提取總DNA.利用Oligo6.2軟件設(shè)計(jì)三對(duì)引物把線粒體DNA的D-loop區(qū)分成三段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用單鏈核苷酸多態(tài)性(SSCP)電泳篩選可疑突變區(qū)域.在發(fā)生突變的包含線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定熱點(diǎn)區(qū)D310區(qū)的128-599片段的PCR產(chǎn)物直接送交測(cè)序.測(cè)序結(jié)果用軟件DNASTAR與已公布的劍

4、橋序列比較以分析突變的頻率和分布,序列變化根據(jù)Mitomap database判斷為多態(tài)性或新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性和突變位點(diǎn).第三部分:以第一部分所得的連接有線粒體DNA D-loop區(qū)片段的克隆載體質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn),用real-time實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)與第二部分相同的四組標(biāo)本進(jìn)行mtDNA拷貝數(shù)的絕對(duì)定量測(cè)定,并分析各組的差異.結(jié)論:我們的研究發(fā)現(xiàn)了乳腺癌線粒體DNA顯示了更高頻率的D-loop區(qū)的突變.同時(shí)也證實(shí)乳腺癌的D-loop區(qū)中D310的

5、C-strech單核苷酸重復(fù)區(qū)是點(diǎn)突變、插入/缺失突變的熱點(diǎn).D-loop區(qū)尤其是D310區(qū)的變化可能通過(guò)改變線粒體的復(fù)制速度影響了線粒體的功能從而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生.遺傳性乳腺癌家系成員伴隨遺傳累積了更多的突變由此導(dǎo)致了對(duì)損害和癌癥的易感性.線粒體DNA D-loop區(qū)263位點(diǎn)的A<,→>G和489位點(diǎn)的T<,→>C可能是中國(guó)人群中共有的突變位點(diǎn);而310位點(diǎn)的T<,→>C,311-312位點(diǎn)的TC insert,522-523位點(diǎn)的