內(nèi)毒素脂多糖受體CD14單克隆抗體免疫毒素的研制及臨床意義.pdf

1、背景：小兒膿毒性休克是兒科重癥監(jiān)護(hù)的常見疾病，也是死亡的主要原因。膿毒性休克是由微生物及其毒素等產(chǎn)物引起微循環(huán)障礙和器官功能不全的危急重癥，臨床治療十分棘手。目前，它的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。過去很長時間，人們從微循環(huán)學(xué)說來解釋休克的發(fā)病機(jī)制，認(rèn)為休克是一個以急性微循環(huán)障礙為主的綜合征，是由于循環(huán)血容量減少，引起器官血液灌流不足和細(xì)胞功能紊亂。近年來，有學(xué)者對膿毒性休克發(fā)病機(jī)制提出了炎癥失控學(xué)說，膿毒性休克并非細(xì)菌感染直接作用，而是機(jī)體對

2、感染性因素的反應(yīng)，反應(yīng)啟動后不再依賴原觸發(fā)因素，常規(guī)的抗感染難以遏制這一進(jìn)程。在膿毒性休克發(fā)生發(fā)展過程中，體內(nèi)出現(xiàn)大量作用廣泛而復(fù)雜的細(xì)胞因子，它們相互作用形成許多正反饋環(huán)而導(dǎo)致“瀑布效應(yīng)”，使細(xì)胞因子過度產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。目前，該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但是CD14作為LPS(脂多糖)受體，介導(dǎo)LPS性細(xì)胞反應(yīng)，在膿毒性休克病理反應(yīng)中對炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放起著關(guān)鍵的作用，越來越被人們重視。CD14能識別、結(jié)合LPS或LPS/LBP

3、(脂多糖朋旨多糖結(jié)合蛋白)復(fù)合物，介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、膿毒性休克等病理反應(yīng)中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素是誘導(dǎo)休克和器官衰竭的主要介質(zhì)之一。國外研究表明，阻滯內(nèi)毒素的產(chǎn)生，抑制其活性，能減輕機(jī)體對細(xì)菌感染的一系列反應(yīng)，降低膿毒性休克的病死率。但目前，國內(nèi)類似研究及文獻(xiàn)較少，因此我們進(jìn)行了本課題研究。 目的：本課題擬通過雙功能光敏偶合劑Sulfo—SANPAH在體外進(jìn)行2F9(我院自行研制的CD14單抗)

4、與Genistein的交聯(lián)來完成2F9—SANPAH—Genistein(簡稱2F9—Gen)的研制，研究其對表達(dá)mCD14單核細(xì)胞體外的靶向殺傷作用，可能為膿毒性休克的抗介質(zhì)治療研究提供一種治療工具，同時為進(jìn)一步研究膿毒性休克的發(fā)病機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。 材料與方法： 1.2F9亞類的鑒定 用正常人的外周血單個核細(xì)胞，2F9雜交瘤培養(yǎng)上清，通過間接熒光標(biāo)記法，流式細(xì)胞術(shù)檢測2F9亞類。 2.2F9腹水

5、的制備、純化和鑒定 按常規(guī)方法制備大量腹水并經(jīng)硫酸錢鹽析初步純化，并將初步純化的2F9過Econo—PacR Protein A Cartridge純化。純化后2F9樣品采用十二烷基磺酸鈉—聚丙稀酸胺凝膠不連續(xù)電泳(SDS—PAGE)，考馬斯亮藍(lán)染色后，分析單抗重鏈和輕鏈分子量及抗體純度估計(jì)。 3.2F9—FITC的制備 參考改良Marsshall法，用異硫氰酸熒光素(Fluoresceini sothiocya

6、nate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記純化的2F9單抗，多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去，并用紫外分光光度計(jì)測定OD495及OD280值。 4.2F9基礎(chǔ)抗體的阻滯試驗(yàn) 取2F9雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1ml，按照常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)檢測法，觀察其對自身直標(biāo)單抗2F9—FIFC和進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)直標(biāo)單抗CD14—FITC的阻滯效果。 5.2F9—Gen的研制 將直標(biāo)純化單抗2F9—FITC與Genistein(酪氨酸激酶抑制劑4’，5，7

7、—三羥基異黃酮)在體外通過雙功能光敏偶合劑Sulfo—SANPAH交聯(lián)。 6.2F9—Gen對單核細(xì)胞體外的靶向殺傷 取適量正常人的外周血，分離出淋巴細(xì)胞并分別加入不同量的PBS，2F9，2F9—Gen及Gen，培養(yǎng)24小時后用AnnexinⅤ—FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測。 結(jié)果： 1.2F9單抗亞型鑒定： 鼠抗人抗體2F9的重鏈?zhǔn)莵喰蜑镮gG1；其輕鏈亞型為κ。2F9抗體亞型為鼠IgG1κ。

8、 2.2F9腹水的制備、純化和鑒定 經(jīng)色譜分析柱過柱分離，雜蛋白與2F9單抗被完全分開。純化后的2F9單抗經(jīng)SDS—PAGE凝膠電泳，可見分子量為57.92KD的重鏈及30.29KD的輕鏈，未見其他雜蛋白條帶，得到純化的2F9單抗。 3．直標(biāo)單抗2F9—FITC的成功制備： 采用改良Marsshall法，成功研制2F9—FITC，通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)，2F9—FITC與標(biāo)準(zhǔn)的CD14—FITC具有相當(dāng)?shù)奶禺?/p>

9、性和敏感性。 4.2F9—SANPAH濃度的檢測 2F9—SANPAH的濃度為0.35mg/ml(0.0019886mmol/L)。 5.2F9—Gen的成功研制 2F9—Gen的濃度為0.15mg/ml(0.0008571mmol/L)。 6.2F9—Gen對單核細(xì)胞體外的靶向殺傷 2F9—Gen和Gen在體外對單核細(xì)胞均有殺傷作用，但2F9—Gen殺傷作用大于Gen。 結(jié)論：