TGF-β1介導(dǎo)HMGA2調(diào)節(jié)CDK6對膀胱癌細(xì)胞周期的影響.pdf

1、第一部分 HMGA2與CDK6在膀胱癌組織標(biāo)本中的表達(dá)關(guān)系
　　目的：
　　在膀胱癌組織標(biāo)本中分析HMGA2與CDK6表達(dá)之間的相關(guān)性。方法：
　　利用免疫組化方法分析99例膀胱癌組織中HMGA2與CDK6的表達(dá)關(guān)系。將99例膀胱癌組織標(biāo)本按照其病理結(jié)果分為低級別組和高級別組，依據(jù)免疫組化結(jié)果，分別分析兩組標(biāo)本HMGA2與CDK6表達(dá)強(qiáng)度是否具有相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　在99例膀胱癌組織中，HMGA2與C

2、DK6表達(dá)呈中度正相關(guān)（r=0.5068，P<0.0001）；在高級別組中，HMGA2與CDK6表達(dá)呈中度正相關(guān)（r=0.5301，P=0.0022）；在低級別組中，HMGA2與CDK6表達(dá)呈低度正相關(guān)（r=0.3715，P=0.0018）；在高級別組中，二者表達(dá)相關(guān)性高于低級別組。
　　結(jié)論：
　　1.在99例膀胱癌組織中，HMGA2與CDK6表達(dá)呈中度正相關(guān)。
　　2.腫瘤惡性程度越高，HMGA2與CDK6在組織中

3、表達(dá)相關(guān)性越強(qiáng)
　　第二部分在膀胱癌細(xì)胞系中TGF-β1對HMGA2及CDK6表達(dá)的影響
　　目的：
　　在TGF-β1刺激后，檢測膀胱癌細(xì)胞HMGA2及CDK6的變化情況，并分析二者表達(dá)的關(guān)系；構(gòu)建HMGA2過表達(dá)膀胱細(xì)胞株為進(jìn)一步研究HMGA2與CDK6表達(dá)水平、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期的關(guān)系做鋪墊。
　　方法：
　　TGF-β1分別刺激RT4和J82細(xì)胞株后，在不同濃度和不同時(shí)間分別利用RT-PCR及we

4、sternblot的方法檢測CDK6、HMGA2 mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)量。將攜帶針對HMGA2及CDK6的shRNA的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入J82細(xì)胞后，經(jīng)TGF-β1刺激后測定HMGA2及CDK6的表達(dá)量。
　　利用RT-PCR方法從基因組中將HMGA2 mRNA編碼蛋白序列擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的片段經(jīng)T-A克隆載體導(dǎo)入pLVX-Tight-Puro質(zhì)粒載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，所得病毒轉(zhuǎn)染RT4細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，得到改造

5、后的穩(wěn)定細(xì)胞株。利用CCK8方法檢測HMGA2過表達(dá)細(xì)胞株與對照組增殖情況，westernblot的方法檢測CDK6蛋白水平的表達(dá)量。利用PI染色流式細(xì)胞儀分析HMGA2過表達(dá)后細(xì)胞周期的變化情況。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)TGF-β1刺激后，RT4細(xì)胞在6小時(shí)時(shí)HMGA2及CDK6表達(dá)水平同時(shí)達(dá)到最大，在J82細(xì)胞中，經(jīng)刺激后HMGA2及CDK6表達(dá)水平在24小時(shí)同時(shí)達(dá)到最大。同時(shí)HMGA2及CDK6的表達(dá)水平也隨TGF-β1的

6、濃度增加而增大。
　　在J82細(xì)胞中，當(dāng)HMGA2被瞬時(shí)干擾后，CDK6表達(dá)也隨之下降，細(xì)胞周期被阻滯在G1期細(xì)胞增多（P<0.05）；HMGA2表達(dá)被干擾的細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后，CDK6表達(dá)無明顯上升，G1期細(xì)胞百分比無明顯減少（P>0.05）。當(dāng)CDK6被瞬時(shí)干擾后，HMGA2的表達(dá)不受影響。
　　RT4細(xì)胞過表達(dá)后，從第2天開始與對照組相比增殖速度加快（P<0.01），J82細(xì)胞HMGA2干擾后，從第2天開始較對照