SEMA3F通過抑制Rac1調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞干性的機(jī)制及臨床病理學(xué)意義.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性消化道腫瘤，《全球癌癥報(bào)告2014》數(shù)據(jù)提示中國(guó)新增的癌癥例數(shù)及死亡人數(shù)的總和居世界首位，其中以包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的消化道惡性腫瘤與其他系統(tǒng)腫瘤相比發(fā)生率較高。因此，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展的主要機(jī)制，探討腫瘤形成過程中的分子基礎(chǔ)及作用機(jī)制，將為未來的結(jié)直腸癌患者的個(gè)性靶向治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　近年來，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）理論的提出為結(jié)直腸癌的治療提供了

2、新的思路。我們前期研究證實(shí)神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子SEMA3F具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能及體內(nèi)成瘤能力，但SEMA3F對(duì)腫瘤細(xì)胞干性特征的影響及分子機(jī)制未見報(bào)道。神經(jīng)叢素A1（PlexinA1）作為SEMA3F的受體，胞內(nèi)具有能夠活化GTPase的結(jié)構(gòu)域，使其實(shí)現(xiàn)GDP非激活形式與GTP激活形式的轉(zhuǎn)換，它可以傳導(dǎo)SEMA3F對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移及運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GTPase還能夠參與腫瘤干細(xì)胞的干性維持。同時(shí)我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、提示結(jié)直腸癌干細(xì)胞低表達(dá)軸突導(dǎo)向因子SEMA3F，此外，SEMA3F的表達(dá)還與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示神經(jīng)軸突誘導(dǎo)因子SEMA3F可能在腫瘤的起始過程中發(fā)揮著重要作用。
　　因此我們推測(cè)SEMA3F可能通過靶向GTPase對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性特征具有抑制作用。在本研究中，我們通過體內(nèi)構(gòu)建SEMA3F ShRNA干擾載體及過表達(dá)的慢病毒，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至人結(jié)直腸癌細(xì)胞系，觀察調(diào)節(jié)SEMA3F的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的自我更新能力及體內(nèi)

4、成瘤能力的影響，觀測(cè)調(diào)節(jié)SEMA3F的表達(dá)對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，特別是Wnt/β-Catenin信號(hào)通路激活的影響。重點(diǎn)檢測(cè)了GTPase在改變調(diào)節(jié)SEMA3F表達(dá)后的改變情況，通過外源性抑制劑及小干擾RNA的處理，驗(yàn)證其在SEMA3F調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞干性特征過程中的作用。最后，我們調(diào)研了人類結(jié)直腸癌標(biāo)本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表達(dá)狀況，探尋三者與腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤病理學(xué)特征之間的關(guān)系。
　　主要結(jié)果和

5、結(jié)論如下：
　　1.SEMA3F可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性特征；
　?。?）過表達(dá)SEMA3F的表達(dá)后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系中相關(guān)干性基因的表達(dá)（如 Nanog、Oct4、Sox2）；（2）干擾 SEMA3F的表達(dá)后可以顯著增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的Nanog、Oct4、Sox2的表達(dá)水平；（3）上調(diào)SEMA3F的表達(dá)后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116的LGR5的表達(dá)水平；（4）上調(diào)SEMA3F的表達(dá)后可以顯著抑制結(jié)

6、直腸癌細(xì)胞系HCT116的LGR5陽性群體的比例（3.31％±0.33%、4.0%±0.83%，0.75%±0.15%，p<0.05）；（5）上調(diào)SEMA3F的表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116的克隆形成率由21.67±1.63%、21±1.70%下降到12.0±0.82%（p<0.05），而結(jié)直腸癌細(xì)胞 HCT116成球能力則由22.33±2.78%、20.67±1.72%下降到8±1.47%（p<0.05）；（6）干擾SEMA3F的表

7、達(dá)后可以顯著增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116的LGR5的蛋白表達(dá)水平及LGR5陽性群體的比例（3.31%±0.33%、4.0%±0.83%，8.92%±1.15%，p<0.05）；（7）干擾SEMA3F的表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞克隆形成能力由20.83±0.76%、20.33±2.02%上升到26.83±1.26%（p<0.05），而細(xì)胞的成球能力則由28.0±2.64%、23.67±2.06%上升到47.67±2.74%，

8、具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；（8）干擾SEMA3F的表達(dá)后可以顯著增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116的體內(nèi)成瘤能力，無論是腫瘤的發(fā)生率還是腫瘤的生長(zhǎng)速度，干擾SEMA3F的結(jié)直腸癌細(xì)胞都明顯優(yōu)于對(duì)照組，而當(dāng)同時(shí)注射1×106個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞時(shí)，干擾組的結(jié)直腸癌細(xì)胞形成的移植瘤的體積（347.872±90.66mm3、277.35±54.166mm3 VS1025.96±169.5mm3，p<0.05）與重量（0.0299±0.029

9、g、0.068±0.006g VS0.4426±0.1279g，p<0.05）都顯著高于對(duì)照組。
　　2.SEMA3F的表達(dá)可以使Wnt信號(hào)通路的激活受到抑制；
　?。?）上調(diào)SEMA3F的表達(dá)后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中Wnt信號(hào)通路的活性（0.489±0.06、0.465±0.08 VS0.15±0.005，p<0.05），同時(shí)β-catenin的表達(dá)水平也被明顯抑制；（2）干擾SEMA3F的表達(dá)后可以顯著

10、增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中Wnt信號(hào)通路的活性，熒光值由1.59±0.06、1.19±0.09增加到6.56±0.79，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；（3）干擾SEMA3F的表達(dá)后可以顯著增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中總β-catenin的表達(dá)水平，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胞漿中的β-catenin無明顯改變，干擾組中胞核的β-catenin的表達(dá)水平上調(diào)。
　　3.GTP-Rac1介導(dǎo)了SEMA3F對(duì)結(jié)直腸癌干性特征的

11、調(diào)控；
　　（1）干擾SEMA3F的表達(dá)后可以顯著上調(diào)基因ARHGEF7及GTPBP4的表達(dá)水平；（2）過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞的SEMA3F表達(dá)水平后可以顯著抑制基因ARHGEF7及GTPBP4的表達(dá)水平；（3）干擾SEMA3F的表達(dá)后可以顯著增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的GTP-Rac1激活；（4）過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞SEMA3F的表達(dá)水平后可以顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系中GTP-Rac1的激活；（5）對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116而言，外源性G

12、TP-Rac1的抑制劑NSC23766的有效藥物濃度為75uM，而LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2及GTP-Rac1的表達(dá)水平皆隨藥物濃度的增高而降低；（6）用75mM外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理干擾組及對(duì)照組細(xì)胞時(shí)，敲低SEMA3F所導(dǎo)致的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2上調(diào)均能被逆轉(zhuǎn)；（7）用75mM外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理干擾S

13、EMA3F及對(duì)照組結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116及SW480時(shí)，敲低SEMA3F所引起的細(xì)胞克隆形成能力及成球能力的上調(diào)均能被逆轉(zhuǎn)（；8）用75mM外源性GTP-Rac1的抑制劑NSC23766處理過表達(dá)SEMA3F及對(duì)照組結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116時(shí)，SEMA3F抑制細(xì)胞克隆形成能力及成球能力的現(xiàn)象能得到增強(qiáng)；（9）用小干擾RNA處理干擾組及對(duì)照組細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)干擾SEMA3F所引起的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2

14、的上調(diào)也能被逆轉(zhuǎn)。
　　4.人類結(jié)直腸癌標(biāo)本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表達(dá)狀況及臨床意義
　?。?）SEMA3F表達(dá)定位于正常組織黏膜上皮細(xì)胞及早期結(jié)直腸癌組織的胞漿中，隨著腫瘤級(jí)別的增高而呈遞減趨勢(shì)，SEMA3F的表達(dá)與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及病人的復(fù)發(fā)臨床病理特征顯著負(fù)相關(guān)，同時(shí)SEMA3F高表達(dá)的病人其預(yù)后較好；（2）GTP-Rac1高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織中，隨著腫瘤患者TNM分期

15、的增高而呈遞增趨勢(shì)，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及復(fù)發(fā)等病理特征呈明顯正相關(guān)關(guān)系，且GTP-Rac1表達(dá)水平高的病人其預(yù)后往往較差；（3）LGR5高表達(dá)于結(jié)直腸癌腫瘤組織及腫瘤侵襲前緣，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、腫瘤的侵潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等病理特征呈明顯正相關(guān)關(guān)系，而高表達(dá)LGR5的病人預(yù)后較差，通過免疫熒光及免疫組化雙標(biāo)，SEMA3F及LGR5的表達(dá)無明顯的共定位現(xiàn)象，呈現(xiàn)“此起彼伏”的表達(dá)現(xiàn)象；

16、（4）SEMA3F的表達(dá)與GTP-Rac1的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，SEMA3F高表達(dá)的病人其GTP-Rac1的表達(dá)水平較低，同時(shí)SEMA3FlowGTP-Rac1high病人的生存期最短，單因素及多因素分析提示聯(lián)合GTP-Rac1及SEMA3F是結(jié)直腸癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)；
　　本文總結(jié)如下：SEMA3F可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的自我更新能力，敲低SEMA3F的表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力得到了增強(qiáng)；SEMA3F的表達(dá)可以抑制Wnt