木犀草素激活Nrf2途徑對(duì)高糖環(huán)境下腎臟系膜細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、背景和目的：
　　糖尿病腎病(DN)是引起終末期腎臟病(ESRD)的主要原因之一，其患病率逐年升高。目前關(guān)于DN的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療DN的效果仍不能令人滿意。目前研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病腎病的核心，而抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵在于上調(diào)核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)的活性，中和ROS，促進(jìn)抗氧化蛋白及酶的釋放，如γ-GCS、TrxR1等，緩解系膜細(xì)胞增生抑制和肥大，減緩腎功能丟失。目前臨床常用的抗氧化劑如維生素E等，不論是臨

2、床療效，亦或是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都無法給出很好的支持證據(jù)，故仍需努力尋找更有效的Nrf2的激活劑?，F(xiàn)今，已有很多關(guān)于木犀草素藥理的研究，提出木犀草素廣泛存在于菊花、金銀花、透骨草及白毛夏枯草等中藥中，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、拮抗腫瘤等作用。2010年有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木犀草素通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型中有一定的腎臟保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在明確木犀草素是否能通過激活Nrf2途徑來緩解氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)腎臟系膜細(xì)胞，

3、延緩糖尿病腎臟病的進(jìn)展，為糖尿病腎病的治療提供新的手段。
　　研究方法：
　　將體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞分別設(shè)正常對(duì)照組、高糖組、高糖+木犀草素低劑量組、高糖+木犀草素高劑量組、和高糖+tBHQ組。用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)不同濃度木犀草素及tBHQ干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因表達(dá)強(qiáng)度;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組系膜細(xì)胞內(nèi)ROS的含量;流式細(xì)胞儀法檢測(cè)各組系膜細(xì)胞的大小;綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染法聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)單位細(xì)胞面積;Ki6

4、7間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況;Western Blot法檢測(cè)高糖環(huán)境中木犀草素不同濃度下系膜細(xì)胞內(nèi)的p-p65、Nrf2、TrxR1、γ-GCS的含量。Western Blot法檢測(cè)不同藥物及藥物劑量下TrxR1、γ-GCSc及γ-GCSm、Nrf2的含量。
　　結(jié)果：
　　(1)觀察到不同濃度木犀草素處理后，Nrf2基因表達(dá)強(qiáng)度隨著木犀草素的濃度變化呈現(xiàn)遞增趨勢(shì);25nmol/L、75nmol/L、200nmol

5、/L3個(gè)濃度組P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;其他濃度組P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)在陽性對(duì)照組tBHQ的不同濃度中Nrf2總體也呈遞增趨勢(shì)，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　(2)高糖組中ROS含量較正常組明顯升高(P＜0.05)，木犀草素及tBHQ藥物干預(yù)組ROS量較高糖組減少(P＜0.05)，在tBHQ組中減少最多，同時(shí)木犀草素400nmol/L組較木犀草素100nmol/L減少的更多。
　　(3)觀察到高糖環(huán)境

6、中細(xì)胞數(shù)較正常環(huán)境中系膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，而在木犀草素及tBHQ組中增多，且木犀草素400nmol/L組中系膜細(xì)胞數(shù)最多。
　　(4)高糖環(huán)境中的系膜細(xì)胞比其他干預(yù)組細(xì)胞肥大，木犀草素干預(yù)組及tBHQ組系膜細(xì)胞與高糖組細(xì)胞相比明顯減小，且木犀草素400nmol/L組細(xì)胞較100nmol/L組細(xì)胞更小，提示木犀草素干預(yù)效果呈劑量依賴型。
　　(5)平均GFP+標(biāo)記的細(xì)胞總面積中，高糖組的系膜細(xì)胞面積較正常組明顯增大(P＜0.05

7、);而在木犀草素各濃度組及tBHQ組中系膜細(xì)胞面積比高糖組小(P＜0.05)，木犀草素400nmol/L組細(xì)胞面積較100nmol/L更小。
　　(6)用不同濃度的木犀草素作用于系膜細(xì)胞后，Western Blot可見Nrf2在木犀草素100nmol/L-400nmol/L及tBHQ組增多，尤其是濃度在木犀草素100nmol/L時(shí)增多更為明顯;TrxR1在木犀草素100nmol/L-400nmol/L濃度及tBHQ中較正常組增多，

8、且在木犀草素100nmol/L濃度下增多最多;γ-GCSc及γ-GCSm在木犀草素各濃度及tBHQ組增多均較明顯，且在木犀草素200nmol/L時(shí)增加最多。
　　(7)高糖處理系膜細(xì)胞后，用木犀草素100nmol/L、400nmol/L及tBHQ干預(yù)，Western Blot見高糖組P-P65較正常組增高明顯，與高糖組相比，木犀草素及tBHQ干預(yù)組明顯減少，且在木犀草素中有著濃度相關(guān)性的表現(xiàn);見高糖組Nrf2較正常組稍增多，與高糖

9、組比較，木犀草素各組及tBHQ組升高較明顯，尤其在木犀草素100nmol/L組最為明顯;TrxR1在高糖組及各藥物干預(yù)組均升高，集中在木犀草素100nmol/L組中;γ-GCSc在高糖組及木犀草素100nmol/L組升高明顯，但與正常組及高糖組相比，木犀草素400nmol/L組及tBHQ組γ-GCSc含量稍低;與正常組相比，γ-GCSm在木犀草素400nmol/L組升高，在其他組均降低，與高糖組相較而言，木犀草素兩組含量均稍高。