Megsin基因?qū)Ω咛黔h(huán)境下小鼠腎臟系膜細(xì)胞PDGF-BB、pERK1-2、TGF-β1的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。近年來(lái),隨著生活水平的提高,生活方式的改變,DN的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),其逐漸成為導(dǎo)致終末期腎衰竭(end-stage renalfailure,ESRF)的首位或主要病因,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 DN的主要病理學(xué)表現(xiàn)為腎臟體積增大,腎小球基底膜增厚,系膜細(xì)胞增生、肥大及系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellula

2、r matrix,ECM)進(jìn)行性積聚,并逐步發(fā)展為腎小球硬化。系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞的一種,在維持腎小球的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用,同時(shí)不可避免的參與了DN的發(fā)病過(guò)程。Megsin是一種系膜細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因,定位于染色體18q21.3,同源性分析顯示該基因?qū)儆趕eprin超家族一員。Serpin功能廣泛、成員眾多,主要參與血液凝固、纖維蛋白溶解、補(bǔ)體激活、炎癥反應(yīng)、及組織重建等過(guò)程,對(duì)細(xì)胞增生、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)代謝等

3、發(fā)揮重要影響。Megsin作為serpin的成員之一,勢(shì)必參與系膜細(xì)胞的某些生理、病理活動(dòng),因此探討megsin在腎小球系膜細(xì)胞中的作用對(duì)于深入揭示DN的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　 DN的發(fā)生、發(fā)展是多種因素綜合作用的結(jié)果,如生化代謝紊亂、腎小球血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子異常分泌、氧化應(yīng)激等,其中PDGF、TGF-β是兩類(lèi)對(duì)系膜細(xì)胞增殖和ECM積聚具有重要影響的細(xì)胞因子。研究表明,高糖環(huán)境下,腎小球系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(t

4、ransforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(platelet derived growthfactor-BB,PDGF-BB)的mRNA表達(dá)均增高,ERK(extracellularsignal-regulated protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。PDGF-BB可能通過(guò)ERK通路作用于系膜細(xì)胞,上調(diào)TGF-β1mRNA的表達(dá),促進(jìn)ECM如纖維連接蛋白(FN)的合成,抑

5、制ECM的降解,參與腎小球硬化的過(guò)程。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成員,是胞內(nèi)介導(dǎo)胞外刺激的重要信號(hào)系統(tǒng)之一,其包括兩個(gè)高度同源的亞類(lèi)ERK1/ERK2,通過(guò)磷酸化修飾而被激活。激活的ERK將外界信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi),參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡等多種生理反應(yīng)的過(guò)程。另有研究發(fā)現(xiàn),大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染megsin基因后,可見(jiàn)PDGF-BBmRNA的表達(dá),其TGF-β1mRNA的表達(dá)也顯著上調(diào),兩者與轉(zhuǎn)染megsin基因呈時(shí)

6、間依賴(lài)關(guān)系。也就是說(shuō)大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染megsin基因后,可刺激細(xì)胞PDGF-BB、TGF-β1的分泌,從而推測(cè)在DN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,megsin與PDGF—BB、TGF-β1之間勢(shì)必存在著密切聯(lián)系,但megsin與ERK之間是否存在聯(lián)系目前尚未知曉。
　　 本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞,對(duì)系膜細(xì)胞megsin基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù),探討高糖環(huán)境中過(guò)表達(dá)megsin基因的小鼠腎小球系膜細(xì)胞合成ECM的變化,以及經(jīng)高糖刺激后過(guò)表

7、達(dá)megsin基因的腎小球系膜細(xì)胞可能的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。進(jìn)一步研究在高糖環(huán)境中,megsin基因是否會(huì)通過(guò)PDGF-BB影響ERK通路從而促進(jìn)系膜細(xì)胞增生和ECM積聚,希望能夠進(jìn)一步揭示DN的發(fā)病機(jī)制,為DN的防治提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:將培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為六組:即正常對(duì)照組(A組,D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖組(B組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+空質(zhì)粒組(C組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖

8、+megsin質(zhì)粒組(D組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin質(zhì)粒+ERK.通路抑制劑組(E組,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+siRNA組(F組,D-葡萄糖30mmol/L)。大量提取己構(gòu)建的megsin表達(dá)質(zhì)粒、空質(zhì)粒和megsin siRNA表達(dá)質(zhì)粒,按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)應(yīng)用脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒(western blot法測(cè)定各組細(xì)胞megsin蛋白表達(dá)量以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率)并給予相應(yīng)刺激,分別在培養(yǎng)12、24、

9、48小時(shí)后,采用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot方法測(cè)定各組系膜細(xì)胞megsin、PDGF-BB、磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)、TGF—β1及FN的表達(dá),RIA法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(結(jié)果用總蛋白校正)。
　　 結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在正常糖環(huán)境下,pERK1/2存在于系膜細(xì)胞的胞漿中,呈淺棕黃色,表達(dá)較弱；高糖刺激12h后可見(jiàn)pERK1/2由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移,且隨時(shí)間延長(zhǎng),胞核中表達(dá)逐漸增強(qiáng),呈

10、深棕黃色強(qiáng)表達(dá),且胞漿中表達(dá)也明顯高于正常組(P<0.05)；高糖環(huán)境下,系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染megsin基因后此種趨勢(shì)更顯著。應(yīng)用ERK通路抑制劑后,pERK1/2于胞漿、胞核中的表達(dá)均被明顯抑制。從12h開(kāi)始,B組較A組小鼠系膜細(xì)胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平開(kāi)始升高,48h達(dá)到高峰(P<0.05)；C組和B組同期相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)；D組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、

11、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平升高,差異有顯著性意義(P<0.05)；E組與D組同期相比,megsin和PDGF-BB的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平下降,差異有顯著性意義(P<0.05)；F組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF—β1和FN蛋白水平降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 Western blot結(jié)果顯示:從12h開(kāi)始

12、,B組較A組小鼠系膜細(xì)胞megsin、PDGF—BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平開(kāi)始升高,48h達(dá)到高峰(P<0.05)；C組和B組同期相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)； D組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平升高,差異有顯著性意義(P<0.05)；E組與D組同期相比,megsin和PDGF-BB的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05),pERK1/2和TGF-β1蛋白水平下降,差異有顯

13、著性意義(P<0.05)；F組與B組同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 放射免疫測(cè)定顯示:從12h開(kāi)始,B組小鼠系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(細(xì)胞總蛋白濃度校正)較A組開(kāi)始升高,48h達(dá)到高峰(P<0.05)；C組與B組同期相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)；D組與B組同期相比,系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度升高,差異有顯著性意義(P<0.05)

14、；E組與D組同期相比,系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。F組與B組同期相比,系膜細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度降低,差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),高糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞ERK通路活化,megsin、PDGF—BB、TGF—β1、Ⅳ型膠原及FN的表達(dá)增加。高糖環(huán)境下過(guò)表達(dá)megsin基因可進(jìn)一步上調(diào)系膜細(xì)PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型膠原及FN的表達(dá)。