三維培養(yǎng)體系誘導(dǎo)心臟瓣膜再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人成體細(xì)胞與干細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)
　　第一節(jié)：人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定與保存
　　目的：體外分離、培養(yǎng)人源性的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（hAVICs）和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVECs），行細(xì)胞表型鑒定，并擴(kuò)增后冷凍保存，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供成熟細(xì)胞來(lái)源。
　　方法：采用膠原酶消化法，從人主動(dòng)脈瓣葉中分離培養(yǎng) hAVICs，從人臍靜脈中分離培養(yǎng)hUVECs。傳代擴(kuò)增后將第二代（P2）細(xì)胞-80℃保

2、存。行光學(xué)顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞表型。
　　結(jié)果：膠原酶消化法成功地分離培養(yǎng)hAVICs和hUVECs。原代hAVICs在普通光鏡下，呈長(zhǎng)梭形并有較多向外延伸偽足狀結(jié)構(gòu)；免疫熒光染色法表型鑒定提示α-SM A和vimentin染色均呈陽(yáng)性。原代hUVECs普通光鏡下呈短梭狀或多邊形單層緊密排列；免疫熒光染色法表型鑒定提示PECAM/CD31和vWF染色均呈陽(yáng)性。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)

3、采用膠原酶消化法所獲得的hAVICs表達(dá)成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，hUVECs表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　第二節(jié)：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定與保存
　　目的：體外分離培養(yǎng)人源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）和人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞（hEPCs），行細(xì)胞表型鑒定，并擴(kuò)增后冷凍保存，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來(lái)源。
　　方法：采用全骨髓差異貼壁法，從人胸骨骨髓液中分離培養(yǎng)hBMSC

4、s，采用密度梯度離心法從人臍血中分離培養(yǎng)hEPCs，傳代擴(kuò)增后-80℃保存。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物；成骨與成脂誘導(dǎo)法分別誘導(dǎo)hBMSCs定向分化；吞噬DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-I實(shí)驗(yàn)鑒定hEPCs功能。
　　結(jié)果：全骨髓差異貼壁法成功分離培養(yǎng) hBMSCs，密度梯度離心法成功分離培養(yǎng)hEPCs。原代hBMSCs在普通光鏡下呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)排列呈漩渦狀；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示細(xì)胞表面CD

5、34、CD45陰性表達(dá)，C D73、CD90、CD105、CD166陽(yáng)性表達(dá)；定向誘導(dǎo)分化2周后，茜素紅染色及油紅O染色陽(yáng)性。原代hEPCs普通光鏡下呈典型集落樣生長(zhǎng)，呈鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示細(xì)胞表面CD34、CD133、CD309陽(yáng)性表達(dá)，CD31、vWF陰性表達(dá)；吞噬 DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-I實(shí)驗(yàn)鑒定顯示雙陽(yáng)性。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓差異貼壁法所獲得hBMSCs，經(jīng)表型鑒定

6、顯示細(xì)胞表面不表達(dá)造血系標(biāo)記物，而表達(dá)非造血系特異標(biāo)記物，且能在定向誘導(dǎo)下分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。采用密度梯度離心法所獲得hEPCs，經(jīng)表型鑒定顯示細(xì)胞表面不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，而表達(dá)非造血系特異標(biāo)記物，且吞噬DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-I實(shí)驗(yàn)呈雙陽(yáng)性。均與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　第二部分 MMPs酶敏感型水凝膠的制備與性能檢測(cè)
　　目的：制備MMPs酶敏感型水凝膠，體外檢測(cè)其理化性質(zhì)。
　　方法：利

7、用20,000Da四分枝狀乙烯砜基聚乙二醇（4-arm-PEG-VS）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）敏感型底物肽和促粘附RGD肽，通過(guò)Michael加成反應(yīng)制備MMPs酶敏感型水凝膠。肉眼觀察水凝膠大體形態(tài)特征；掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)；稱量法測(cè)定溶脹率和自然降解率；小應(yīng)變震蕩剪切流變儀測(cè)量機(jī)械特性；熒光定量法測(cè)定酶解率；皮下包埋法測(cè)定生物相容性。
　　結(jié)果：通過(guò)Michae l加成反應(yīng)成功制備酶敏感型水凝膠。肉眼觀察其大體形態(tài)呈果凍樣

8、，無(wú)色透明、易吸水溶脹；掃描電鏡提示表面呈均勻空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。稱量法測(cè)定溶脹率為44.7％；小應(yīng)變震蕩剪切流變儀測(cè)定存儲(chǔ)模隨頻率和應(yīng)力增加無(wú)明顯變化，而損失模逐漸降低；稱量法測(cè)定4周自然降解率為20.3%；熒光定量法測(cè)定14d酶解率為81.2%；皮下包埋法檢測(cè)提示在體免疫反應(yīng)僅有極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所制備MMPs酶敏感型水凝膠具有較高溶脹性、適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力學(xué)性能、良好的可降解性和生物相容性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，可成為一種

9、較理想的組織工程心臟瓣膜（TEHV）支架材料。
　　第三部分三維培養(yǎng)體系的構(gòu)建與性能檢測(cè)
　　目的：構(gòu)建三維培養(yǎng)體系，觀察將其用于培養(yǎng)TEHV種子細(xì)胞的效果。
　　方法：利用hVICs、hUVECs制備相應(yīng)條件培養(yǎng)基。同第二部分制備MMPs酶敏感型水凝膠，然后封裝種子細(xì)胞hBMSCs、hEPCs和hVICs、hUVECs相應(yīng)條件培養(yǎng)基，構(gòu)建多重三維培養(yǎng)體系。光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；CA-PI法測(cè)定細(xì)胞活性；

10、CCK-8法和CFDA-SE染色法測(cè)定細(xì)胞增殖；免疫熒光法和Western-Blot法測(cè)定細(xì)胞分化。
　　結(jié)果：利用酶敏感型水凝膠封裝種子細(xì)胞和條件培養(yǎng)基，成功制備多重三維培養(yǎng)體系。普通光鏡下可見細(xì)胞在三維體系中繼續(xù)生長(zhǎng)，呈透明、圓形、氣泡樣結(jié)構(gòu)，且均勻分散；熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)呈綠色，胞核呈藍(lán)色；CA-PI法提示三維體系內(nèi)大量分布攜帶綠色熒光的活細(xì)胞，極少量攜帶紅色熒光的死細(xì)胞；CCK-8法和 CFDA-SE染色法提