封裝條件培養(yǎng)基三維體系誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：體外分離擴(kuò)增臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），觀察內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基（HUVEC-CM）誘導(dǎo)EPCs分化效果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　方法：酶消化法于臍靜脈上獲得內(nèi)皮細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)，免疫組化法對其鑒定，獲取上清液作為CM；密度梯度離心法和差速貼壁法從新鮮臍血中分離獲得

2、EPCs，鑒定細(xì)胞表型CD34、CD133、eNOS、CD309、CD31，細(xì)胞免疫組化法觀察細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1功能；應(yīng)用HUVEC-CM體外誘導(dǎo)EPCs定向分化，實(shí)驗(yàn)分組為：空白對照組（A），VEGF干預(yù)組（B），實(shí)驗(yàn)組（C），用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法繪制生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)分析干預(yù)前和培養(yǎng)第15d時(shí)上述EPCs表型變化。在不同時(shí)間點(diǎn)取C組上清液用

3、ELISA法檢測MMP-2的分泌，為后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)備。
　　結(jié)果：光鏡下HUVECs形成鋪路石樣鑲嵌排列，vWF免疫組化染色陽性，成功獲得HUVEC-CM；EPCs光鏡下呈扁平短梭形或多角形，呈團(tuán)簇樣分布。攝取乙?；兔芏戎鞍祝ˋc-LDL），荊豆凝集素-1（UEA-1）及vWF免疫組化染色反應(yīng)陽性，流式細(xì)胞術(shù)提示該細(xì)胞群為EPCs且純度較高；HUVEC-CM誘導(dǎo)EPCs定向分化：B、C兩組之間五項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

4、，而A組與B、C組在CD34、eNOS、CD309、CD31指標(biāo)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CD133無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），A組與誘導(dǎo)前組CD133、CD34、eNOS有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），其余兩指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B、C組與誘導(dǎo)前比較，五項(xiàng)表型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。CCK-8法提示C組細(xì)胞生長快于B組和A組。C組上清含MMP-2，并隨細(xì)胞數(shù)量增加而增加。
　　結(jié)論：成功獲取HU

5、VECs和EPCs；HUVEC-CM可以誘導(dǎo)臍血EPCs向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。
　　第二部分 酶敏感水凝膠封裝條件培養(yǎng)基構(gòu)建三維培養(yǎng)體系的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察酶敏感水凝膠體外降解情況；分析二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)對HUVECs的影響；觀察封裝HUVEC-CM三維培養(yǎng)體系對EPCs分化的影響。
　　方法：根據(jù)Michael加成反應(yīng)，20,000D4branched-PEGDA與MMP-2底物肽（GWGPQGIWCQDRCG）合

6、成酶敏感水凝膠Ⅰ，加入外源性MMP-2后，用分光光度儀測量其上清吸光度；4branched-PEGDA與MMP-2底物肽（GCRDGPQGIWG QDRCG）合成酶敏感水凝膠Ⅱ。封裝HUVECs建立三維培養(yǎng)體系作為三維培養(yǎng)組，HUVECs常規(guī)孔板貼壁為二維培養(yǎng)組，CCK-8法繪制兩組細(xì)胞生長曲線，；為了觀察封裝條件培養(yǎng)基三維體系對EPCs分化影響，酶敏感水凝膠Ⅱ封裝EPCs和HUVEC-CM建立三維培養(yǎng)體系為實(shí)驗(yàn)組，封裝EPCs和PBS

7、為對照組，CCK-8法觀察細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞增殖示蹤熒光探針Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester（CFDA-SE）染色法激光共聚焦三維重建觀察細(xì)胞空間分布及生長情況，流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞分化情況。
　　結(jié)果：成功合成兩種酶敏感水凝膠。在外源性MMP-2作用下酶敏感水凝膠Ⅰ降解，降解率隨著酶濃度增大而增加；光鏡下，二維培養(yǎng)組第9d出現(xiàn)脫壁細(xì)胞，未脫壁細(xì)胞排列緊密，體積縮小。生長

8、曲線第9d時(shí)達(dá)最大值，隨后減小。三維培養(yǎng)組內(nèi)，細(xì)胞在水凝膠內(nèi)僅見細(xì)胞呈球形，狀態(tài)良好。生長曲線在第13d超過二維培養(yǎng)組且未出現(xiàn)平臺(tái)期；兩組細(xì)胞經(jīng)CFDA-SE染色三維重建后，細(xì)胞呈綠色球形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量增加，而且實(shí)驗(yàn)組增殖速度快于對照組。CCK-8法檢測顯示實(shí)驗(yàn)組生長曲線比對照組更陡峭。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：實(shí)驗(yàn)組較對照組CD34降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組CD133差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，幾乎檢測不到；內(nèi)皮