人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞系的建立與鑒定.pdf

1、目的:
　　本實驗擬通過改進和完善對人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)的方法，在體外建立可重復(fù)的人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞系，對其生物學(xué)行為進行研究。并從基因及蛋白角度檢測MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在其的表達，以期證明體外所培養(yǎng)的是具有扁平苔蘚病理特征的細胞系。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng):
　　選擇臨床及WHO標準病理確診的白紋型口腔扁平苔蘚患者頰黏膜活檢標本;采用冷酶消化法分離細胞，選用

2、無血清培養(yǎng)基進行原代及傳代培養(yǎng);在相差顯微鏡下觀察并記錄細胞形態(tài)變化;MTT法測定細胞的生長曲線，研究此細胞體外生長的增殖情況。
　　2.細胞鑒定:
　　采用免疫熒光法進行上皮細胞角蛋白檢測，確定上皮性來源;采用免疫組化法對波形蛋白進行檢測，排除成纖維細胞混雜;掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，進一步鑒定細胞特性;基因檢測Cytochrome C、Cytochrome B、18S rDNA，確定細胞種屬性。
　　3.

3、細胞表達特異性:
　　免疫熒光測定MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在OLP角質(zhì)形成細胞和正常角質(zhì)形成細胞內(nèi)的表達;RT-PCR法和Western-blot法測定MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在OLP角質(zhì)形成細胞同正常角質(zhì)形成細胞在基因及蛋白水平的表達差異。
　　結(jié)果:
　　1.白紋型OLP角質(zhì)形成細胞可在無血清培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，可連續(xù)傳5～6代，整個細胞生長期間為單一的角質(zhì)形成細胞，細

4、胞為多角形，長到一定密度呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，符合上皮細胞生長形態(tài)特征。OLP角質(zhì)形成細胞的生長曲線基本呈“S”型，傳代周期約6～7d，一般7d左右能達90％以上融合。
　　2.角蛋白間接免疫熒光反應(yīng)陽性，即角蛋白陽性表達，定位于胞漿，能夠鑒定培養(yǎng)細胞為角質(zhì)形成細胞。免疫組化陰性，即波形蛋白陰性表達，能夠說明所培養(yǎng)細胞為單一角質(zhì)形成細胞，無成纖維細胞混雜。掃描電鏡顯示:細胞周邊微絨毛呈輻射狀，長短不一;因微絨毛是上皮細胞的特征性結(jié)構(gòu)

5、之一，可以鑒定所培養(yǎng)細胞為上皮來源的角質(zhì)形成細胞。透射電鏡顯示:正常角質(zhì)形成細胞內(nèi)可見大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，橋粒等結(jié)構(gòu)，細胞連接緊密;OLP角質(zhì)形成細胞內(nèi)可見大量的空泡性結(jié)構(gòu)，部分空泡內(nèi)有吞飲細胞器后的膜性結(jié)構(gòu)，這一病理性變化與OLP組織的特征性超微結(jié)構(gòu)變化相一致，能夠進一步鑒定我們培養(yǎng)的細胞為OLP角質(zhì)形成細胞。通過提取細胞的DNA，進行Cytochrome C、Cytochrome B、18S rDNA測序分析，說明培養(yǎng)的細胞為人源性

6、。
　　3.免疫熒光，RT-PCR及Western-blot結(jié)果表明MMP-2、MMP-9、CK-10在OLP角質(zhì)形成細胞質(zhì)中較正常角質(zhì)形成細胞表達高，CK-19表達低，說明所培養(yǎng)的細胞具有OLP的部分病理特征。
　　結(jié)論:
　　1.白紋型OLP角質(zhì)形成細胞可在體外培養(yǎng)，連續(xù)傳代5-6代，細胞呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，符合上皮細胞形態(tài)特征。
　　2.通過角蛋白間接免疫熒光法、波形蛋白免疫組化法、超微結(jié)構(gòu)、種屬性等細胞定