口腔扁平苔蘚動物模型的初步建立及化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚患者前后血清中差異蛋白的定量研究.pdf

1、第一部分：口腔扁平苔蘚動物模型的初步建立
　　目的：采用口腔扁平苔蘚患者病變組織勻漿輔以弗氏佐劑針刺劃痕法，在NOD/SCID小鼠頰黏膜建立口腔扁平苔蘚的動物模型。并嘗試在應(yīng)用人PBL建立具有人免疫學(xué)特性的NOD/SCID小鼠模型的基礎(chǔ)之上建立口腔扁平苔蘚的動物模型。
　　方法：
　　1.OLP-NOD/SCID小鼠模型的建立
　　用少許OLP患者病變組織來制備組織勻漿。選取12只NOD/SCID小鼠，鼠齡4周，

2、雌性，體重20～25 g，動物體形豐滿，發(fā)育正常，行動迅速，反應(yīng)靈敏，被毛濃密有光澤，食欲良好。飼養(yǎng)和各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作均在動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級的層流實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將其隨機(jī)分為2組，每組6只。第1組為對照組，采用生理鹽水針刺N(yùn)OD/SCID小鼠頰黏膜4周，隔兩天針刺一次。第2組為實(shí)驗(yàn)組，采用OLP患者病變組織勻漿輔以弗氏佐劑針刺頰黏膜4周，隔兩天針刺一次。處理4周處死，于作用處頰黏膜取材。制成HE染色的病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

3、r>　　2.Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型建立及鑒定
　　2.1.將18只NOD/SCID小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只；第1組，每只腹腔注射人外周血淋巴細(xì)胞2×107/0.5ml，作為人免疫重建低劑量組；第2組，每只腹腔注射人外周血淋巴細(xì)胞4×107/0.5ml，作為人免疫重建高劑量組；第3組，每只腹腔注射0.5ml生理鹽水，作為空白對照組。
　　2.2.從生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性兩個方面對小鼠模型進(jìn)行鑒定：每天觀察小鼠

4、的生物學(xué)體征；第8周摘眼球取血，利用流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血中人CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.OLP-NOD/SCID小鼠模型的建立
　　肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組針刺劃痕組織勻漿后，針刺部位黏膜充血，質(zhì)地脆弱。鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組病理結(jié)果：黏膜上皮不全角化，棘細(xì)胞層增生，基底細(xì)胞可見輕度空泡變性，上皮釘突不規(guī)則延長，固有層散在淋巴細(xì)胞浸潤，但固有層還未出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤帶的OLP典型病理表現(xiàn)。肉眼觀察對照組黏膜

5、無明顯變化，鏡下觀察病理結(jié)果：黏膜上皮過度角化，固有層未見炎細(xì)胞浸潤。
　　2.Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型建立及鑒定
　　第1組小鼠到第8周營養(yǎng)狀態(tài)、精神狀態(tài)良好；通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血中人CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞雙陽性表達(dá)率為3.03±0.47％，表達(dá)量不足，未能建立起Hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型。第2組到第8周后發(fā)生GVHR反應(yīng)，并且死亡1只；通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血中人CD3+、CD

6、4+T淋巴細(xì)胞雙陽性表達(dá)率為36.13±4.79%。雖然淋巴細(xì)胞已達(dá)到一定數(shù)量，但小鼠出現(xiàn)了GVHR。第3組小鼠體健，營養(yǎng)狀態(tài)、精神狀態(tài)良好，通過流式細(xì)胞儀未檢測到小鼠外周血中有人CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)。
　　第二部分：化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚患者前后血清中差異蛋白的定量研究
　　目的：本課題小組前期應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳及質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定出化濕行瘀清熱方治療口腔扁平苔蘚患者前、后的血清差異蛋白，發(fā)現(xiàn)人抗凝

7、血酶Ⅲ、維生素D結(jié)合蛋白等在治療OLP前后的血清中存在差異表達(dá)，并通過Western-blot給予了初步的半定量驗(yàn)證。為進(jìn)一步探討化濕行瘀清熱方對口腔扁平苔蘚的影響作用，本研究擬采用ELISA技術(shù)在蛋白水平上行進(jìn)一步準(zhǔn)確的定量研究，為OLP可能的發(fā)病機(jī)制及化濕行瘀清熱方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取20例OLP患者，采集治療前和經(jīng)化濕行瘀清熱方治療8周后的靜脈血，靜置30min后離心，吸取上層血清。采用ELI

8、SA對OLP患者治療前后血清中差異蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行定量研究。
　　結(jié)果:
　　ELISA結(jié)果顯示人抗凝血酶Ⅲ，維生素D結(jié)合蛋白在口腔扁平苔蘚患者治療后的血清中濃度較治療前均下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用組織勻漿+弗氏佐劑針刺劃痕后的病變部位已出現(xiàn)黏膜上皮不全角化，棘細(xì)胞層輕度增生，基底細(xì)胞輕度液化變性，上皮釘突不規(guī)則延長，固有層散在淋巴細(xì)胞浸潤的病理表現(xiàn)，較前期實(shí)驗(yàn)的黏膜上皮出現(xiàn)棘層增生