?;撬釋m頸癌細胞自噬與凋亡的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.觀察牛磺酸對人宮頸癌細胞凋亡的影響及其初步機制。
  2.觀察牛磺酸對人宮頸癌細胞自噬的影響及其初步機制。
  方法:
  1.MTT法檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM,320 mM)分別處理宮頸癌細胞系HeLa及SiHa24 h,48 h,72 h后對細胞存活率的影響,以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系。
  2.采用Western blotting法檢測Tau(

2、0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM)及CQ20μM分別處理宮頸癌細胞系HeLa和SiHa48 h后,凋亡相關(guān)蛋白MST1、Bax、Bcl-2和自噬相關(guān)蛋白 LC3-II,LC3-I,Beclin1變化,評價Tau對凋亡和自噬的影響。
  3.采用RT-qPCR檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM)及CQ20μM分別處理宮頸癌細胞系HeLa和SiHa48 h后,MST1,Ba

3、x,Bcl-2,Caspase-3凋亡相關(guān)mRNA及AKT,Beclin1自噬相關(guān)mRNA的表達水平,評價Tau對凋亡和自噬的影響。
  4.收集細胞并用PBS沖洗,采用Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒檢測Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM),CQ20μM及高表達MST1基因?qū)iHa細胞凋亡的影響。
  5.用Tau(0 mM,40 mM)處理對數(shù)生長期HeLa細胞

4、48 h后,單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色觀察自噬泡的形成。
  6.將GFP-RFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細胞,用熒光顯微鏡觀察Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80mM,160 mM),CQ20μM處理48 h后細胞內(nèi)綠色熒光斑點和紅色熒光斑點的聚集情況檢測自噬水平。
  結(jié)果:
  1.MTT法顯示Tau對人宮頸癌細胞系HeLa和SiHa具有增殖抑制作用,并呈時間-劑量依賴性,Tau對人宮頸癌

5、細胞系HeLa和SiHa增殖抑制作用明顯增加(P<0.01)。計算Tau作用人宮頸癌細胞系HeLa和SiHa后的IC50值發(fā)現(xiàn),Tau對HeLa細胞的增殖抑制能力大于SiHa細胞。
  2.Western Blot顯示在HeLa細胞中,Tau40 mM組相對其它濃度組能夠顯著升高MST1蛋白表達(P<0.01),在SiHa細胞中,MST1蛋白表達隨著Tau濃度逐漸升高而升高。2種細胞的Bcl-2蛋白表達均隨著Tau濃度逐漸升高而降

6、低(P<0.01),Bax蛋白表達均隨著Tau濃度逐漸升高而升高(P<0.05)。而對自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin1的表達情況,2種細胞Beclin1蛋白表達均隨著Tau濃度逐漸升高而降低(P<0.01),胞漿型 LC3(即LC3-I)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3(即LC3-II)隨著Tau濃度逐漸升高而減少,LC3-II\LC3-I比值減少(P<0.01)。
  3. RT-qPCR顯示在HeLa和SiHa細胞中,Bax和MST

7、1的表達顯著上調(diào)(P<0.01),Caspase-3稍有上調(diào)(P<0.05),Bcl-2的表達顯著下調(diào)(P<0.01),AKT的表達顯著上調(diào)(P<0.01),Beclin1的表達顯著下調(diào)(P<0.01),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
  4.高濃度Tau誘導(dǎo)凋亡SiHa細胞凋亡。體外介導(dǎo)p-EGFP-MST1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SiHa細胞凋亡率升高,與?;撬幔?60 mM)聯(lián)合處理時,細胞凋亡率的升高更明顯(P<0.01)
  5.MDC可被

8、細胞吸收并選擇性地結(jié)合到自噬囊泡膜上,使自噬泡在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)為黃綠色或深綠色點狀結(jié)構(gòu)。Tau40 mM MDC陽性細胞的熒光強度及細胞內(nèi)MDC熒光顆粒數(shù)目較Control組明顯減少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa細胞自噬。
  6.在HeLa和SiHa細胞中Tau處理組較Control組、CQ20μM組綠色熒光斑點和紅色熒光斑點的數(shù)量明顯減少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa細胞自噬。
  結(jié)論:
  1.T

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