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文檔簡介
1、目的:(1)觀察可吸入溫石棉纖維對A549細(xì)胞增殖抑制和凋亡作用;(2)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞過程,活性氧(reactive oxygen species,ROS)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)對細(xì)胞凋亡的影響;(3)觀察可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞過程ROS與JNK通路之間的相互作用,進(jìn)一步探索溫石棉誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。
方法:(1)篩選可吸入溫
2、石棉纖維作用時間和濃度:以A549細(xì)胞為體外實驗研究對象,不同濃度的溫石棉(12.5、25、50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞不同時間(12、24、48h),同時設(shè)置陰性對照組,MTT法檢測細(xì)胞存活率;(2)觀察A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞24h,同時設(shè)置陰性對照組,使用Hoechst33258試劑染色,熒光顯微鏡下觀察并記錄;(3)探索ROS、JNK通
3、路對A549細(xì)胞凋亡的影響及兩者之間的關(guān)系:不同濃度的溫石棉(50、100、200μg/mL)分別作用A549細(xì)胞24h,并設(shè)置陰性對照組、JNK抑制組(SP600125干預(yù))、ROS抑制組(NAC干預(yù)),AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法分析各組的細(xì)胞凋亡率;JC-1熒光探針法檢測各組線粒體膜電位的下降程度;PI染色檢測各組細(xì)胞周期的分布變化;DCFH-DA熒光探針負(fù)載法檢測各組ROS產(chǎn)生水平;Western blot檢測p-JN
4、K蛋白、JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)變化。
結(jié)果:(1)可吸入溫石棉纖維可抑制A549細(xì)胞增殖,呈現(xiàn)濃度、時間效應(yīng)關(guān)系:與陰性對照組比較,溫石棉作用細(xì)胞12h時,溫石綿組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)下降(P<0.05);溫石棉作用細(xì)胞48h時,細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01),其中以100、200μg/mL溫石棉組細(xì)胞存活率下降最為明顯;溫石棉作用A549細(xì)胞24h后,以50、100、200μg/mL溫石棉組細(xì)
5、胞存活率分別為(74.86±6.95)%、(70.04±6.52)%、(59.78±5.18)%,為方便觀察實驗結(jié)果,選擇濃度為50、100、200μg/mL的可吸入溫石棉纖維作用A549細(xì)胞24h進(jìn)行后續(xù)實驗。(2)與陰性對照組相比,不同濃度溫石棉作用A549細(xì)胞后,細(xì)胞整體熒光強(qiáng)度增加,出現(xiàn)較多皺縮濃染的亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞。細(xì)胞間隙增大,形態(tài)縮小、變圓,有的呈空泡狀改變,有的可見胞核濃染,甚至可見較多碎裂的凋亡小體以及馬蹄形(新月形)胞
6、核形態(tài)改變。(3)50、100、200μgfmL溫石棉組細(xì)胞凋亡率分別為(23.05±3.44)%、(31.67±1.55)%、(64.04±2.78)%,同時伴有ROS水平增高、線粒體膜電位下降、p-JNK蛋白及cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)增加,細(xì)胞周期停滯在G2/M期。(4)抑制JNK通路后,p-JNK蛋白的表達(dá)下降(P<0.05),溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的JNK抑制組凋亡率分別為(16.28±1
7、.83)%、(25.20±3.11)%、(52.82±4.57)%,線粒體膜電位的下降、cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的增加受抑制(P<0.05)。(5)當(dāng)溫石棉濃度為50、100μg/mL時,抑制JNK通路對細(xì)胞周期改變無明顯作用(P>0.05);溫石棉濃度為200μg/mL時,抑制JNK通路能改善細(xì)胞的G2/M期停滯(P<0.05)。(6)當(dāng)溫石棉濃度為50、100μg/mL時,抑制JNK通路不能抑制ROS的產(chǎn)生(P>0。
8、05);溫石棉組濃度為200μg/mL時,抑制JNK通路能減少ROS的產(chǎn)生(P<0.05)。(7)抑制ROS產(chǎn)生后,ROS產(chǎn)生水平下降,溫石棉濃度為50、100、200μg/mL的ROS抑制組凋亡率分別為(12.26±0.97)%、(20.52±1.82)%、(47.38±2.94)%,線粒體膜電位下降受抑制,細(xì)胞G2/M期停滯有改善,p-JNK蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。
結(jié)論:(1
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