結(jié)節(jié)病肉芽腫C57BL-6小鼠模型Th17-Treg免疫平衡紊亂的研究.pdf

1、目的:
　　 利用結(jié)核分枝桿菌超氧化物歧化酶(superoxidaseA，SodA)多肽建立結(jié)節(jié)病肉芽腫C57BL/6小鼠模型。研究結(jié)節(jié)病肉芽腫小鼠模型肺組織內(nèi)Treg/Th17細(xì)胞分化的改變及一些相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，分析Treg/Th17細(xì)胞分化與相關(guān)細(xì)胞因子水平變化的關(guān)系，進(jìn)一步探索結(jié)節(jié)病發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制。
　　 方法:
　　 一.結(jié)節(jié)病肉芽腫C57BL/6小鼠模型的制備及鑒定
　　 21只雌

2、性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:第1天:實(shí)驗(yàn)組A組:皮下注射SodA50μg與不完全弗氏佐劑(IFA)0.25ml，B組:皮下注射IFA0.25ml+PBS0.25ml;C組:皮下注射PBS0.5ml。第14天:A組:SodA與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)于0.5mlPBS(SodA50μg+瓊脂糖珠6000粒)中，尾靜脈注射;B組:瓊脂糖珠6000粒(溶于0.5mlPBS)尾靜脈注射;C組:PBS0.5m1尾靜脈注射;第22天小鼠麻醉

3、脫頸椎處死。
　　 觀察小鼠肺部及外周淋巴結(jié)大體變化;HE染色觀察肺組織、淋巴結(jié)病理組織學(xué)變化，觀察有無結(jié)節(jié)病樣肉芽腫形成;肉芽腫陽性的切片行免疫組化染色檢測巨噬細(xì)胞特異性抗原Mac-2及淋巴細(xì)胞抗原CD4+T的表達(dá);行支氣管肺泡灌洗，檢測支氣管肺泡灌洗液中(BALF)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比，流式細(xì)胞學(xué)檢測BALF中CD4+/CD8+細(xì)胞比例;流式多因子檢測技術(shù)檢測肺組織均漿的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-1

4、2及Th2型細(xì)胞因子IL-4水平。
　　 二.結(jié)節(jié)病小鼠模型肺組織Th17/Treg細(xì)胞分化及相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化
　　 Q-PCR檢測小鼠肺組織內(nèi)Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子孤兒核受體γt(Orphan nuclearreceptor gamma t，RORγt)的mRNA及Treg的特異轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)的

5、mRNA表達(dá)，Western Blot檢測RORγt、Foxp3的蛋白表達(dá);采用流式多因子檢測技術(shù)檢測肺組織勻漿內(nèi)與Th17/Treg相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β、IL-6、IL-17A水平，并分析相關(guān)細(xì)胞因子與Th17/Treg分化的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1、A組小鼠解剖后可見外周（頸部、腋下、腹股溝）及肺門等處多發(fā)淋巴結(jié)明顯腫大。B組、C組肺部、外周淋巴結(jié)未發(fā)現(xiàn)明顯異常。
　　 2、A組小鼠肺組織及淋巴結(jié)切

6、片HE染色后可見支氣管周圍大量淋巴細(xì)胞浸潤，肺組織內(nèi)可見多發(fā)非干酪壞死性肉芽腫形成，該肉芽腫中心由類上皮樣細(xì)胞組成，有的可見多核巨細(xì)胞浸潤，肉芽腫周邊淋巴細(xì)胞包繞。淋巴結(jié)經(jīng)病理切片HE染色也可見多個(gè)結(jié)構(gòu)類似的類圓形肉芽腫形成。B組肺內(nèi)可見瓊脂糖珠子周圍薄層巨噬細(xì)胞包裹的異物肉芽腫形成，淋巴結(jié)未見明顯異常;C組肺部、淋巴結(jié)未見明顯異常。
　　 3、免疫組化染色顯示A組肉芽腫中心巨噬細(xì)胞特異性抗原Mac-2表達(dá)陽性，周邊CD4+T淋

7、巴細(xì)胞表達(dá)陽性。
　　 4.A組BALF中淋巴細(xì)胞比例、中性粒細(xì)胞比例顯著高于B、C組，巨噬細(xì)胞比例顯著低于B、C組（P均＜0.01）;B組淋巴細(xì)胞比例高于C組，巨噬細(xì)胞比例低于C組(P均＜0.01）;B、C組中性粒細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);A組BALF的CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著高于B組(P=0.0019);
　　 5.A組肺組織勻漿上清IL-12、IFN-γ顯著高于B、C組(P均＜0.01），B

8、組、C組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;A組肺組織勻漿上清IL-4表達(dá)水平與B、C組之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 6.A組肺組織Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平顯著高于B、C組（P均＜0.05），B組、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);A組肺組織Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的mRNA相對表達(dá)量顯著低于B、C組（P均＜0.05），B、C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;Foxp3蛋白表達(dá)水平與B

9、、C組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05）。
　　 7A組肺組織勻漿上清中IL-6、IL-17A濃度顯著高于B、C組（P均＜0.01），B、C組之間IL-6、IL-17A無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05）;各組TGF-β水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＞0.05);
　　 8.小鼠肺組織RORγt mRNA表達(dá)和肺組織IL-6水平呈顯著正相關(guān)(r=0.701，p=0.000)，與IL-17A水平顯著正相關(guān)(r=0.631，P=0.002

10、)，RORγt蛋白表達(dá)與IL-6水平呈顯著正相關(guān)(r=0.705，P=0.000)，與IL-17A水平顯著正相關(guān)(r=0.546，P=0.010)。Foxp3的mRNA表達(dá)和肺組織IL-6水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.444，P=0.044)，與IL-17A水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.471，P=0.031)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SodA可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠的淋巴結(jié)、肺組織形成結(jié)節(jié)病樣非干酪樣壞死性肉芽腫，免疫反